RP-HPLC法测定急性溴苯腈中毒小鼠肝组织腺苷酸含量

周小明 翁杰 王志翊 龚裕强

肝脏是机体最大的解毒器官，肝细胞能量代谢是肝脏解毒功能的物质基础，肝组织腺苷酸含量的变化直接反映肝脏能量代谢状况，是评价肝脏损害和药物保护效果的有效指标。目前国内外检测组织腺苷酸含量的方法大多时间慢，过程复杂[1－2]。本实验采用一种改良的反相高效液相色谱（RP－HPLC）法测定急性溴苯腈中毒小鼠肝组织三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、磷酸腺苷（AMP）含量变化，旨在为研究肝脏能量代谢变化提供较为快速、理想的方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 实验小鼠由温州医科大学实验动物中心提供，24只成年雄性SD大鼠，体重250～300g。老鼠被安置在塑料笼子，提供水和食物，自由摄食。养殖条件为12h光/暗周期，温度保持在（24±2）℃。实验前动物予禁食12h，不禁水，采用随机数字表法分为急性中毒组予溴苯腈（97%溴苯腈原药以10%二甲亚砜为溶媒配成10mg/ml溶液）200mg/kg灌胃染毒和正常对照组（予10%二甲亚砜溶液20ml/kg灌胃），每组12只，两组均于灌胃后6h采用脊椎脱臼法处死。

1.2 仪器与试剂 高效液相色谱仪Agilent1100（美国Agilent公司），高速低温离心机（美国Beckman公司），ATP、ADP、AMP标准品（美国 Sigma公司），97%溴苯腈原药（浙江禾本农药化学有限公司），乙腈（天津四友，色谱纯），10%二甲亚砜溶液、磷酸二氢钾、氯化钾、氢氧化钾、高氯酸(均为国产分析纯），实验用水为超纯水。

1.3 色谱条件 日本岛津C18ODS色谱分析柱（5μm，200mm×4.6mm），流动相A为150mmol/L磷酸二氢钾溶液+150mmol/L氯化钾溶液，用2mol/L氢氧化钾溶液调整溶液pH值至6.0；流动相B为85%流动相A+15%乙腈，所用流动相实验前均经0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，并行超声脱气泡处理。洗脱梯度：0min、3%B，5min、9%B，9min、3%B（B指流动相B），平衡8min。柱温为16℃，检测波长254nm；流速1.1ml/min。

1.4 肝组织样品的制备 处死两组小鼠后分离小鼠的肝脏组织。用液氮预冷的铁夹钳取肝组织，置液氮冷冻后，精确称取肝组织0.3g，加入预冷的0.3mol/L高氯酸溶液3ml，冰浴中用研钵迅速匀浆，匀浆液6000r/min低温4℃离心10min，取上清液，予1mol/L的氢氧化钾调溶液pH值至6.0，再次6000r/min低温4℃离心10min，取上清液，经0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，即得肝组织样本溶液，吸取20μl进行分析，测定肝组织ATP、ADP、AMP 含量。

1.5 标准曲线的绘制 分别称取ATP、ADP和AMP标准品10mg，用超纯水配成1mg/ml的混合母液，分别稀释成 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml的混合标准溶液。根据进样质量浓度和测得的峰面积求取回归方程及相关系数。

1.6 加标回收率的计算 肝组织加入一定量的腺苷酸混合标准品，经沉淀蛋白、中和酸性等处理，测定腺苷酸含量，与同批处理的同一组织样品比较，计算回收率，回收率=(加标测定量-不加标测定量）/加标量×100%计算标准品的回收率。

1.7 精密度的测量 上述色谱条件下，同日内对同一肝组织样本不定时进样6次，测得日内保留时间与峰面积变异系数；上述样品分装，-70℃保存，不同日进样分析，重复6次，测得日间保留时间与峰面积变异系数。

1.8 观察指标 观察并比较两组小鼠肝细胞ATP、ADP和AMP含量差异，判断RP-HPLC法测定急性溴苯腈中毒小鼠肝组织腺苷酸含量是否符合既往研究结果，并观察RP-HPLC法的出峰时间、标准曲线、精密度。

1.9 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，两样本间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 出峰时间 ATP、ADP和AMP的出峰时间分别约为5.7、6.3和8.5 min，3种标准腺苷酸分离较满意，最小分离度R＞2.0，见图1。

图1 标准品色谱图

2.2 标准曲线 结果 ATP、ADP和AMP浓度在 1～200mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，所得直线方程分别为 ATP：y=23.706x-3.3611，R=0.99999；ADP：y=33.549x-15.143，R=0.99998；AMP：y=41.934x-1.6868，R=0.99999。

2.3 加标回收率 见表1。

表1 肝组织腺苷酸含量加标回收率（μg/ml）

2.4 精密度实验 见表2。

表2 保留时间和峰面积变异系数（%）

2.5 两组小鼠肝组织腺苷酸含量比较 与正常组对照比较，急性中毒组ATP含量明显下降（P＜0.05），AMP含量明显升高（P＜0.05），两组小鼠ADP含量比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、表3。

图2 急性中毒组小鼠肝组织ATP、ADP和AMP含量变化

表3 两组小鼠肝组织腺苷酸含量比较（μg/g）

3 讨论

ATP等能量物质是研究疾病能量代谢变化的重要指标[3]，属于不稳定化合物，且生物组织、血浆中存在降解ATP等的酶，为避免实验过程中能量物质的降解，本研究采用低温、加酸使酶失活，抽提ATP时要应尽快将标本移入预冷的高氯酸溶液中，在冰浴中迅速匀浆，使肝细胞破碎，充分提取细胞中的ATP，确保检测结果真实反映肝组织能量代谢情况。本ATP提取方法是目前国内外广泛采用的技术，方法较成熟，具有简便、提取完全等优点。

腺苷酸含量的测定以往多采用电泳、层析或酶学等分析方法，但这些方法操作复杂，灵敏度低，难以推广应用。目前检测腺苷酸含量最常用的分析方法为高效液相色谱（HPLC）法[1-2，4]。笔者采用 RP-HPLC 法，与常规HPLC法相反，RP-HPLC是流动相极性大于固定相极性的色谱。此方法改善了常规色谱中固定液流失分离效果差的缺点，除具备HPLC法的特点外，具有柱效高、灵敏度高、更敏捷等优势[5-7]。RP-HPLC法流动相的种类和配比对分离效果影响很大，笔者采用乙腈磷酸缓冲液作流动相，梯度洗脱，但每次运行梯度洗脱后需重新平衡色谱柱，耗时较长。本研究通过加大流速，改变梯度变化速率，缩短梯度时间等措施，使运行时间明显缩短，样品主峰9min内便获得较好分离。回收率、精密度实验表明，该方法准确性高、重复性较好。

本研究增加实验样本量，通过RP-HPLC法测得急性溴苯腈中毒小鼠肝组织ATP含量明显低于正常小鼠，AMP含量明显升高，与文献[8]报道一致，表明小鼠溴苯腈急性中毒可导致肝脏能量代谢障碍。此外，该技术方法在脑损伤疾病能量代谢研究中也有重要的应用价值[9-11]。RP-HPLC法可快速、灵敏、准确检测不同能量代谢状态下不同组织腺苷酸含量变化，是研究临床疾病能量代谢变化的理想方法，在临床中毒毒理研究[12-13]、生命科学等[14]领域均有一定的应用价值。

[1]郑屹,陈赛慧,叶薇,等.高效液相色谱法检测细胞能量代谢物质的方法建立与应用[J].科技通报,2012,28(7):46-50.

[2]朱会宇,吴丹妮,汪海林.高效液相色谱法测定细胞内三磷酸腺苷及其代谢物的含量[J].色谱,2017,35(1):54-58.

[3]谭敬,朱宇麟,周荣胜,等.乌司他丁对肝大部切除合并缺血再灌注损伤后肝再生和能量代谢的影响[J].西安交通大学学报(医学版),2014,35(1):89-93.

[4]张美玲,张振南,温从丛,等.液相色谱-质谱联用法测定人全血中灭多威[J].中国法医学杂志,2016,31(4):367-372.

[5]张巧真,宋伟明,吴柳松.反相高效液相色谱法测定人血中富马酸喹硫平浓度及其在临床药学中的应用[J].药学实践杂志,2016,34(1):48-51.

[6]Roy C,Panigrahi L,Chakrabarty J.Validated Stability-Indicating RP-HPLC Method for the Estimation of Degradation Behaviour of Organic Peroxide and Third-Generation Synthetic Retinoids in Topical Pharmaceutical Dosage Formulation[J].Sci Pharm,2015,83(2):321-338.

[7]Alam A,Naik KK,Upadhaya NK,et al.Simple,efficient and economicalmethods forisolation and estimation ofnovel isoflavone using RP-HPLC[J].Methodsx,2017,23(4):128-133.

[8]Hu L,Hong G,Ma J,et al.Clearance rate and BP-ANN model in paraquatpoisoned patients treated with hemoperfusion[J].Biomed Research International,2015,2015:298253.

[9]吴彬,金露,王小同,等.慢性低氧高二氧化碳对小鼠大脑线粒体功能的影响[J].温州医学院学报,2010,40(2):115-118.

[10]王志翊,卢中秋,邱俏檬,等.巯基化合物对溴苯腈中毒小鼠脑能量代谢影响[J].中国公共卫生,2010,26(2):239-240.

[11]王志翊,卢中秋,邱俏檬,等.溴苯腈急性中毒小鼠脑组织能量代谢的改变[J].浙江医学,2009,31(2):173-175.

[12]李萌芳,陆长军,邱俏檬,等.二巯丙磺钠对溴苯腈急性中毒小鼠中枢神经毒性作用的干预[J].中华劳动卫生职业病杂志,2010,28(10):752-755.

[13]Yilmaz I,Kaya E,Sinirlioglu ZA,et al.Clinical importance of toxin concentration in Amanita verna mushroom[J].Toxicon,2014,87:68-75.

[14]Wu JL,Yu SY,Wu SH,et al.A sensitiveand practical RP-HPLC-FLD for determination of the low neuroactive amino acid levels in body fluids and its application in depression[J].Neurosci Lett,2016,616:32-37.