miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表达及其靶基因预测的生物信息学分析

潘寿华 朱智荣

膀胱尿路上皮癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，在我国的发病率逐年上升。目前膀胱癌的发病机制尚未完全阐明，推测其发病与多层次的基因紊乱有关[1]。近年来研究表明，微小RNA（miRNA）与多种肿瘤的发生、发展密切相关，通过多种机制在肿瘤的发生、发展中起着重要作用[2－3]。miR－340能调控多种蛋白质的编码及翻译，从而调控细胞周期，影响肿瘤浸润转移等，被称为“抑癌基因”。本研究应用基因芯片及定量聚合酶链反应（PCR）技术检测膀胱尿路上皮癌及正常膀胱黏膜组织中的miR－340表达，并通过对miR－340的靶基因预测、基因注释、功能分析以及信号转导通路富集等一系列生物信息学分析，为miR－340在膀胱尿路上皮癌发生、发展过程中的作用与机制研究提供理论基础。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2016年1至12月在我院进行膀胱尿路上皮癌外科手术治疗的30例患者，男16例，女14 例，年龄 44～79（57.0±8.2）岁。取病变部位和距肿瘤基底部2cm以外的膀胱黏膜组织，新鲜标本离体后，液氮速冻保存，术后病理确诊为膀胱尿路上皮癌，其中非浸润性膀胱组织18例，浸润性膀胱癌组织12例。肿瘤标本的收集及相关资料的分析得到我院伦理委员会的批准，且所有患者均签署知情同意书。

1.2miRNA芯片检测采用Trizol（美国Invitrogen公司）从组织中提取总RNA。用含有0.65%甲醛的1%变性琼脂糖凝胶测定总RNA的完整性。使用NanoDrop 2000核酸蛋白分析仪（美国Thermo Scientific公司）测定总RNA的质量和浓度。miRNeasy小提试剂盒（德国Qiagen公司），依照说明书操作提取miRNA。使用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power标记试剂盒（丹麦Exiqon公司），依照说盒内说明书操作。采用T4 RNA连接酶标记3末端Hy3TM荧光标记1μg RNA，标记后将Hy3TM 标记样品与 miRCURYTMLNAArray（V.16.0）（丹麦Exiqon公司）芯片杂交。使用Axon Genepix 4000B微列扫描仪对芯片扫描。

1.3 实时定量PCR（qRT-PCR）验证 qRT-PCR过程按照标准的TaqMan MicroRNA assay（美国Applied Biosystems公司）操作步骤在ABI7700系统（美国Applied Biosystems公司）上进行扩增。扩增条件：95℃5min，随后 95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 20s，反应 35 个循环。以U6为内参基因进行校正和标准化。应用GenePix proV6.0（美国Axon公司）进行数据分析。miRNA-340正向引物序列为5'-GCGGTTATAAAGCAATGAGA-3′，反向引物由试剂盒自带。内参U6正向引物序列为 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列为 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4 miR-340靶基因预测 应用mirecords数据库（http://mirecords.biolead.org/）进行靶基因预测，在线应用靶基因预测软件筛选miR-340最可能的靶基因。预测 软 件 包 括 ：DIANA-microT、MicroInspector、miRanda MirTarget2、miTarget、NbmiRTar、PicTar、PITA、RNA22、RNAhybrid、TargetScan/TargetScanS，统计同时有 3 个生物软件预测阳性结果的靶基因。

1.5 miR-340靶基因生物信息学分析 miR-340的靶基因集合用 Gene Ontology（GO，http://www.geneontology.org//）进行功能富集分类，GO将基因功能详细划分为分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和细胞组件（cellular component，CC）3 个方面。用BINGO进行GO注释的显著性分析，以P＜0.01为显著性阈值得到具有统计学意义的注释，从而得到基因集合在GO类别上的分布信息。利用David（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）数据库对miR-340的预测靶基因集合进行基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/）数据库的信号通路分析，通过Fish Exact Test计算P值，以P＜0.05为显著性阈值，得到基因集合中具有统计学意义的信号转导通路。

1.6 统计学处理 芯片结果用Genepix Pro V6.0（美国Axon公司）进行排序，中位值对表达数据进行标准化，应用SPSS 18.0统计软件，计量资料两组采用Student ttest分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱尿路上皮癌组织中差异表达的miRNAs 芯片分析结果显示，与正常膀胱黏膜组织比较，膀胱尿路上皮癌组织中有12个miRNA表达上调（＞2倍），8个miRNA表达下调（＜0.5倍），其中上调4倍以上的miRNA 有 miR-191、miR-17-5p、miR-221、miR-106b，下调 4 倍以上的有 miR-340、miR-145、miR-133a、miR-101，其中 miR-340表现为下调（0.12倍）（P＜0.01）见表1。实时定量PCR检测膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱黏膜组织中miR-340的表达，结果显示，与正常膀胱黏膜组织比较，miR-340在膀胱尿路上皮癌组织中表达明显降低，为正常黏膜膀胱组织的0.12倍（P＜0.01），与芯片结果一致，见图1。

表1 膀胱尿路上皮癌组织中差异表达的miRNAs

2.2 miR-340靶基因生物信息学分析结果 实验利 用 DIANA-microT、MicroInspector、miRanda MirTarget2、miTarget、NbmiRTar、PicTar、PITA、RNA22、RNAhybrid、TargetScan/TargetScanS等靶基因在线预测软件对miR-340进行靶基因预测，同时由3个软件预测到的靶基因共有179个。将这些预测到的靶基因利用DAVID数据库进行GO及信号通路的富集分析。结果发现miR-340预测的靶基因分别富集在cell adhesion、biological adhesion、cell-cell adhesion、cell communication、regulation of cellular component movement和regulation of signal transduction等，见表2。通过DAVID数据库对miR-340预测的靶基因集合进行基于KEGG通道富集分析，可见靶基因信号通路富集于pathways in cancer、focal adhesion、adherens junction 和 cell cycle等通路（P＜0.05），见表 3。

图1 膀胱尿路上皮癌组织中miR-340表达为正常黏膜膀胱组织的 0.12 倍（N：normal，T：bladder tumor）

表2 miR-340靶基因的功能富集分析

表3 miR-340靶基因的KEGG通路富集分析

3 讨论

miRNA是发现于真核细胞中的一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA分子，miRNA能通过与靶向 mRNA3′-非翻译区（3′-UTR）互补配对，降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译的机制，在转录后水平调控基因的表达，在细胞的增殖、凋亡、分化、代谢等方面发挥着重要的作用。研究表明，miRNA在多种肿瘤中异常表达，在肿瘤的发生、发展和转移中作为抑癌基因或癌基因起重要的作用[4-5]。大量研究已证实在不同的肿瘤组织中有不同的miRNA表达谱，miRNA基因芯片技术已被广泛地应用于差异表达miRNA的筛选，所揭示的miRNA表达谱可以提供丰富的信息。本研究利用基因芯片技术检测发现，与正常膀胱黏膜组织比较，膀胱尿路上皮癌组织中有15个miRNAs表达上调，10个miRNAs表达下调，其中miR-340表达明显下调，经实时定量PCR证实，miR-340在膀胱尿路上皮癌中明显低表达，与蕊片检测结果一致，说明miR-340在膀胱尿路上皮癌中表达明显下调。

miR-340全长22nt，序列为uuauaaagcaaugagacugauu，编码miR-340的基因定位在5q35.3的179442303-179442397bp区域。miR-340能调控多种蛋白质的编码及翻译，从而调控细胞周期，影响肿瘤浸润转移等，被称为“抑癌基因”[6]。已证实miR-340在乳腺癌[7]、前列腺癌[8]、骨肉瘤[9]及黑色素瘤[10]等实体肿瘤中表达下调，通过介导肿瘤细胞的侵袭、转移等过程影响肿瘤的发生、发展。但miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表达至今鲜有报道。本研究证实miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表达明显下调，miR-340在膀胱尿路上皮癌中可能发挥了抑癌基因的作用。

目前已知miRNA家族是基因表达调控网络中重要组成部分，可能参与多条信号转导通路的调控。miRNA靶基因的确定是研究miRNA生物学功能的关键，对靶基因的功能分析有助于我们对miRNA作用机制的理解。Goswami等[10]研究发现，miRNA-340与小眼畸形相关转录因子（MIFT）mRNA结合后,下调MIFT的表达并抑制其活性，从而抑制黑素瘤形成。Wu等[7]发现，miRNA-340通过降低肝细胞生长因子受体（C-MET）和基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）的表达而抑制乳腺癌细胞的侵袭和浸润。在成神经细胞瘤的研究中发现，miR-340可以诱导成神经细胞瘤凋亡[11]。Cai等[9]发现在小儿骨肉瘤中，miR-340通过ROCK1途径抑制肿瘤细胞生长与侵袭。在泌尿系肿瘤研究中发现，miR-340通过MDM2-p53通路抑制前列腺肿瘤细胞增殖与转移[8]。本研究利用生物信息学方法对miR-340的靶基因进行预测，并对靶基因集合进行功能富集分析和信号转导通路富集分析，发现miR-340的靶基因的生物学功能涉及到肿瘤发生、发展的多个阶段，如转移酶活性、细胞周期调控、转录调控、细胞或基质间黏附以及细胞的分化等，尤其是细胞或基质间黏附功能直接与肿瘤的演进有关[12]。

本研究利用基因芯片技术及实时荧光PCR检测miR-340在膀胱尿路上皮癌中的表达，并进行靶基因的预测及其功能的生物信息学分析，结果显示miR-340在膀胱尿路上皮癌组织中的表达是明显下调的，其靶基因富集于多个生物学过程及与肿瘤相关的信号转导通路上，miR-340可能通过调控某些靶基因的表达参与调控膀胱尿路上皮癌的发生与发展。这些研究有助于提高我们对膀胱尿路上皮癌发生机制的认识，为进一步研究miR-340在膀胱尿路上皮癌发生、发展过程中的机制提供理论依据和实验基础。

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