金针菇中棒曲霉素高效液相色谱检测法的研究

石宝俊，葛 玲，姜洪芳，林群英，朱海亮，张卫明

(1.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042；2.亿利耐雀生物科技有限公司,江苏 南京 210038; 3. 南京大学 生命科学学院, 江苏 南京210093)

金针菇[Flammulinavelutipes(Curt.:Fr.) Sing.]又名冬菇、朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌,隶属担子菌亚门(Basidiomycotina),层菌纲(Hymenomycetes),伞菌目(Agaricales),口蘑科(Tricholomataceae),金钱菌属(Flammulina)[1]。金针菇菌盖滑嫩、菌柄细长脆嫩,形美,味鲜,是世界上著名的食药两用菌和观赏菌[2],具有较高的营养价值和药用价值,有广阔的开发前景。 金针菇在物流运输过程中，极容易受到病原菌的影响，从而感染棒曲霉素的产生菌，产生棒曲霉素，对人体健康造成危害。棒曲霉素(patulin )又名展青霉素，是由曲霉和青霉等常见食源性真菌所产生的一种次级代谢产物[3]。棒曲霉素，分子式为C7H6O4，分子量为154，化学名称4-羟基-4-氢-呋喃(3，2碳)并吡喃-2(6氢)酮(4-hydroxy-4H-furo[3,2C]pyran-2 (6H)-one)，是一种杂环内酮结构化合物。毒理学试验表明，棒曲霉素具有致癌、致畸和免疫受损等毒理作用，对人体有一定危害，可导致呼吸、泌尿、神经等系统的损坏甚至衰弱[4]。棒曲霉素广泛存在于各种霉变的水果蔬菜中，甚至部分有霉变趋势的好果中其含量也比较高[5]。因而，西欧各国对苹果及其制品中的棒曲霉素限量有严格规定，最高限量为50 μg/kg[6]，而欧盟和日本已经将婴儿食品中的这一标准提高到10 μg/kg。目前水果及其制品中棒曲霉素的检测方法日渐成熟，而蔬菜中棒曲霉素的检测研究还很少，尤其金针菇中棒曲霉素的检测几乎无人研究。随着金针菇在食品药品领域的运用，摸索出一种灵敏度，回收率与重复性都很高的检测方法至关重要。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料和仪器

材料：金针菇(镇江田润发生态农业有限公司)，棒曲霉素标准品(≥98%，上海沪峥生物科技有限公司)，乙酸乙酯(AR，南京化学试剂股份有限公司)，冰醋酸(AR国药集团上海化学试剂有限公司，乙腈(HPLC,tedia company)，乙醇(AR，南京化学试剂有限公司),乙酸钠(AR，南京化学试剂有限公司)，无水碳酸钠(AR南京化学试剂有限公司)。

仪器：组织捣碎机(JJ-2BS，峥嵘仪器有限公司)，旋转蒸发仪(RE52-AA，上海亚荣生化仪器厂)，高效液相色谱仪(1200，美国安捷伦公司)，多用循环水式真空泵(SHZ-DⅢ，巩义市予华仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 青霉菌的培养

PDA培养基的制作：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h，纱布过滤，再加10～20 g葡萄糖和17～20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5 mL(试管大小为10 mL)，15磅蒸气(121 ℃)灭菌20 min左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

PD液体培养基的制作：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h，纱布过滤，再加10～20 g葡萄糖，充分溶解后趁热纱布过滤， 121 ℃灭菌20 min左右后取出，冷却后贮存备用。

青霉菌的固体培养：在无菌环境下，将青霉菌菌种接种在PDA培养基上，待长出菌落后，从菌落边缘挑取少量菌丝，接种在PDA培养基的斜面上，28 ℃下培养7天，使菌丝长满斜面。

青霉菌的液体培养：在无菌环境下，挑取少量上述固体培养基中的青霉菌菌丝，置于含有PDA液体培养基的锥形瓶中，在28 ℃下，摇床转速为160 r/min，培养7天，使液体培养基中布满菌丝。

青霉菌混悬液：取斜面固体培养的青霉菌试管，加入蒸馏水，使用刮条轻轻剥离青霉菌丝，转移至喷瓶内，成青霉菌混悬液。

2.2 棒曲霉素标准溶液的配制

配制醋酸-醋酸钠缓冲液：称取醋酸钠5.1 g，加入冰醋酸20 mL，用纯净水稀释定量到200 mL。

配制棒曲霉素对照品储备液：用移液枪吸取少量醋酸-醋酸钠缓冲液置于棒曲霉素标准品样品瓶中，振荡，溶解，不易溶解情况下可适当超声，溶解完全后，用移液枪移至5 mL容量瓶中，用缓冲液少量多次润洗标准品样品瓶，洗液依次移入容量瓶，用缓冲液定容至刻度，成1 mg/mL的棒曲霉素标准品储备液[7]。

2.3 标准曲线的制备

2.3.1 液相色谱条件的摸索

(1)色谱条件

色谱柱：ODS反相柱(C18柱)；检测器：紫外检测器，波长276 nm；柱温：30 ℃。

流动相使用乙腈和水混合。在流速为1 mL/min条件下，观察乙腈与水体积配比分别为 20∶80，15∶85，10∶90对棒曲霉素的分离效果。

在最优体积比下或者各项体积比下，比较不同流速(1.0，0.8，0.6 mL/min)对棒曲霉素的分离效果[8]。

进样量:使用20μL的定量进样环满环进样20μL。

(2)标准工作液的制备

取棒曲霉素对照品储备液(1 mg/mL)，用醋酸-醋酸钠缓冲液稀释10倍得到浓度为100μg/mL的溶液，再用醋酸-醋酸钠缓冲液逐级稀释，得到浓度分别为25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.25μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL的标准溶液。

(3)标准曲线的绘制

在摸索出的色谱条件下满环进样20 μL，每个浓度进样三次，记录色谱峰保留时间、峰高和峰面积，取峰面积的平均值，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，使用Excel绘制标准曲线。

2.3.2 金针菇的制备及检测

金针菇的前处理

空白样:分别称取4份约170 g新鲜金针菇，放置在保鲜盒中，密封，分别于于第4天，第8天，第12天进行棒曲霉素的提取。

青霉菌接种样：分别称取3份约170新鲜金针菇，密封，取现配的青霉菌混悬液，均匀喷洒在金针菇表面，分别于第4天、第8天，第12天进行棒曲霉素的提取。

金针菇的提取分离及纯化：将经处理过后的金针菇使用组织捣碎机打成汁，用无纺滤布过滤，取50 mL金针菇汁，加入乙酸乙酯50 mL，分别萃取三次，每次振荡3 min，弃去水相，合并有机相，用20 mL的1.5%碳酸钠溶液快速洗涤有机相，洗涤时间控制在1 min以内，静置分层后，分离水相和有机相，水相再用少量乙酸乙酯洗涤一次，合并有机相。将有机相在38 ℃水浴上，用旋转蒸发仪蒸发至干，并立即用少量乙酸乙酯淋洗瓶壁3～4次，所得溶液在38～40 ℃水浴上挥去溶剂，再用醋酸-醋酸钠缓冲液定容至3 mL，溶液经样品过滤器过滤后，得到供试品溶液。

青霉菌液体培养液处理样：取上述青霉菌液体培养基得到的布满菌丝块的锥形瓶，用玻璃棒搅拌至菌丝块散落，按上述金针菇汁处理方法，制作成供试品溶液。

金针菇样品的检测：在摸索出的色谱条件下，取各供试品溶液满环进样20μL，每个浓度进样三次，记录色谱峰保留时间、峰高，另进一针棒曲霉素对照品溶液记录保留时间和峰高，根据组分在色谱上的出峰时间与标准组分比较定性。每个供试品溶液进样三次，积分得到样品棒曲霉素峰面积，取平均值，通过标准曲线计算供试品中棒曲霉素浓度。

3 结果与分析

3.1 液相条件摸索结果

在1 mL/min流速下，取5μg/mL的棒曲霉素标准溶液满环进样，在乙腈∶水体积配比分别为20∶80，15∶85时的分离效果都比较好，在乙腈∶水体积配比10∶90时分离效果比较差，其中以乙腈∶水体积配比为15∶85时分离效果最好，因此确定流动相为乙腈∶水(15∶85)。

在确定流动相为乙腈∶水(15∶85)条件下，取5μg/mL的棒曲霉素标准溶液满环进样，在流速为1.0 mL/min时，各峰聚集在3～4 min内，分离效果较差；在流速为0.8 mL/min时，各峰分离效果较好，对照品棒曲霉素出峰时间在7.5 min左右；在流速为0.6 mL/min时，各峰分离效果较好，各峰分离充分，但对照品出峰时间在9 min左右。因标准溶液进样10 min后，并无其他峰出现，拟定走样时间为10 min，因此选取流速为0.8 mL/min作为检测流速。

以1μg/mL浓度棒曲霉素标准溶液进样，按高效液相色谱分析条件测定。

图1 1μg/mL棒曲霉素标准溶液的色谱图

3.2 方法学验证结果

3.2.1 标准品稳定性实验结果

表1 标准品稳定性结果

3.2.2 精密度实验结果

表2 精密度实验结果

3.2.3 检出限和定量限

根据标准工作液的高效液相图谱数据分析，浓度为0.01μg/mL的标准工作液，在以基线平稳的8～10 min为噪声范围，其信噪比为23.7，在检出限和定量限信噪比定义限以上，故标准曲线浓度范围之间的样品浓度均可定量检测。

3.3 标准曲线的绘制

以标准品溶液为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，线性方程为y=112.89x-14.236，R2= 0.998 4。结果表明，棒曲霉素在0.01～25μg/mL浓度范围内线性关系良好。

图2 标准曲线

3.4 样品检测结果

图3 空白样4天高效液相色谱图

图4 青霉菌接种样4天高效液相色谱图

图5 空白样8天高效液相色谱图

图6 青霉菌接种样8天高效液相色谱图

图7 空白样12天高效液相色谱图

图8 青霉菌接种样12天高效液相色谱图

图9 青霉菌液体培养液处理样高效液相色谱图

4 结 论

本试验结果表明，测定棒曲霉素的高效液相法的最佳色谱条件为：乙腈与水体积配比为15∶85；流速为0.8 mL/min。根据检出限和重复性精密度实验结果可知，高效液相法检测棒曲霉素的灵敏度和精密度较高。用液液萃取法提取，碳酸钠净化制备的金针菇供试品，其高效液相谱图杂峰较多，样品净化不充分，棒曲霉素峰面积不稳定。经检测，青霉菌液体培养液处理样中棒曲霉素的含量远远大于其他样品，有明显可见的棒曲霉素峰，其保留时间与工作液中棒曲霉素的保留时间一致，故认为青霉菌感染确会产生棒曲霉素。根据现有数据分析，金针菇供试品中，空白样中棒曲霉素含量在前期要低于青霉菌接种样，但在8天和12天，制备的金针菇样品中，青霉菌接种样中棒曲霉素的含量并未高于空白样，可以认为在8天及以后，棒曲霉素的生成已完成，含量不再增加。或者棒曲霉素在样品处理过程中有所损耗，检测量远远小于实际含量，造成实验结果的差异。

5 讨 论

(1)在决定配制棒曲霉素溶剂方面，本实验曾存在很多疑虑。棒曲霉素具有易溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙醋和氯仿，耐酸，在碱性条件下不稳定；在氯仿、苯、二氯甲烷等溶剂中能较长时期稳定，在水中和甲醇中逐渐分解，溶液蒸干后形成薄膜则不稳定等性质，但目前查阅到的很多文献上，配制棒曲霉素标准液时使用的是甲醇。因不确定棒曲霉素在甲醇中能稳定存在的时间，为了保险起见排除用甲醇配液的方法。GB5009.185—2016上，在配制棒曲霉素标准溶液时，方法为使用乙腈配制棒曲霉素标准储备溶液，在-20 ℃下冷冻保存，有效期长达6个月；用储备液制备标准工作液时，所用溶剂为4 ℃，有效期为3个月。因考虑到乙腈挥发性、棒曲霉素的性质以及实验周期问题，对照所查文献其他样品中棒曲霉素高效液相检测法，本实验直接使用pH 3.6的醋酸-醋酸钠缓冲液制备储备液和标准工作液。在高效液相检测法中，保持PH呈酸性可以避免棒曲霉素的降解。

(2)在比较金针菇空白样和青霉菌接种样放置4天和8天所得的谱图时发现，放置8天的样品谱图中棒曲霉素的峰面积并没有增加，且并没有发现明显的分解峰。考察实验过程，发现两批次的样品过程中，唯一存在较大差异的地方在于38～40 ℃水浴上挥去溶剂过程中，由于高效液相色谱仪使用无空缺，因此溶剂挥干后没有立即配制成供试品溶液进行检测，我们猜测可能是：①由于棒曲霉素在干燥条件下不稳定，易降解；②由于棒曲霉素在生成的环境中，随着时间的延长有可能含量下降，就像植物中某一成分，在某一时间含量达到最高，以后随着时间的延长含量在下降。③实验所采取的提取净化方法效率太低，导致供试品中杂质太多，成分堆积，造成成分分离困难，各峰聚集，造成保留时间延后或者聚集成宽峰，并入其他峰的结果。

参考文献：

[1] 毕志树,郑国扬,李泰辉. 广东大型真菌志[M]. 广州：广东科技出版社，1994.

[2] 刁治民,刘禹宏,田玉华. 青海药用蕈菌[M]. 西宁：青海人民出版社，1994.

[3] 夏红民,岳宁,张鹏.出入境农产品安全卫生检验的重要对象—真菌毒素检验[J].检疫科学,2000(5):56-59.

[4] 蒋雄图,虞左向．棒曲霉素[J]．无锡轻工业学院学报，1989，8 (2)：73-84．

[5] 朱从会．扩展青霉拮抗放线菌的分离、鉴定及其液体培养研究[D]．杨凌：西北农林科技大学，2008：1-2．

[6] ABDORREZA M, ROUYA T, MARZIEH K, et a1．Enzyme-assisted extraction and ionic liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography for determination of patulin in apple juice and method optimization using central composite design [J]．Analytica Chimica Acta,2013，804：104-110．

[7] GOKMEN V，ACAR J，SARIOGLU K．Liquid chromatographic method for the determination of patulin in apple juice using solid-phase extraction[J]．Analytica Chimica Acta，2005，543：64-69.

[8] CHO M S，KIM K，SEO E，et a1．Occurrence of patulin in various fruit juices from South Korea：an exposure assessment[J]．Food Sei Biotechnol，2010，19(1)：1-5.