基于HPLC指纹图谱与聚类分析对不同产地连翘质 量 评 价

张洪峰 张学强 于丽霞 陈 晨 王朝宗

（邯郸市中心医院，河北邯郸056001）

中药连翘为木犀科连翘属多年生落叶灌木植物 连 翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的 干 燥 近成熟果实或成熟果实的果壳，主要分布于山西、河南、河北、陕西等地，含有苯乙醇苷类、木质素类、环烯醚萜类及黄酮类等多种化学成分[1-2]。聚类分析（Cluster analysis，CA）是一种理想的多变量统计技术，根据一批样本的多个指标，找出度量样品之间相似程度的统计量并作为划分类型的依据。样品间距离用于衡量所研究样本之间相似性的程度不同（亲疏关系），聚类分析所得到的结果比传统分类方法更细致、全面、合理。近年来，聚类分析已广泛应用于中药及其制剂分析，属于化学计量学范畴[3]。如袁会琼等[4]用聚类分析法结合HPLC指纹图谱鉴别云南重楼和长柱重楼，肖榕等[5]用UPLC结合聚类分析识别不同产地生/制何首乌。连翘含近80种化合物，化学成分较复杂[6]，现行中国药典靠定量测定连翘苷和连翘酯苷A两个单体成分进行质量控制，故有必要构建连翘藤药材的指纹图谱，全面控制其质量。本实验拟通过HPLC指纹图谱结合聚类分析，探讨不同产地连翘药材的质量。

1 材料

1.1 仪器 Shimadzu LC-15C型高效液相色谱仪（Shimadzu公司），包括岛津LC-15C泵、SPD-15C型紫外检测器、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱、岛津高效液相色谱LC工作站；BSA224S-CW电子天平（德国，Sartorius公司）；SK250HP型超声提取器（科导超声仪器有限公司）；SMART-N15uv超纯水机（香港，Heal Force公司）。

1.2 药材与试剂 连翘药材采集地及时间见表1，经河北医科大学生药学教研室黄芸教授鉴定为 连 翘Forsythia suspensa （Thunb.） Vahl的 果实。甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；水为超纯水；冰醋酸为分析纯。连翘苷（批号：110821-201615）、连翘酯苷A（批号：111810-201606）、连翘酯苷B（批号：111811-201603）及芦丁（批号：100080-201610）均购自中国食品药品检定研究院

表1 连翘产地及采收时间

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shimadzu Wondasil C18（250mm×4.6mm，5µm）色谱柱。流动相A：0.3%冰醋酸水溶液，流动相B：甲醇，梯度洗脱以甲醇-0.3%冰醋酸为流动相。梯度洗脱：0～20min，10%→26%B；20～35min，26%→38%B；35～50min，38%→60%B；50～60min，60%→10%B。检测波长：235nm；柱温：35℃；流速：1.0mL/min。理论塔板数按连翘苷峰计算应不低于5000。

2.2 参照物溶液制备 取连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B及芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成一定浓度的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取本品粉末（过五号筛）约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取按照2.3项下方法制备的同一批连翘药材（S7）供试品溶液，连续进样6次测定，以连翘酯苷A的峰面积和保留时间为参照，对共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别进行考察，计算RSD值。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.23%，相对峰面积RSD值均小于1.49%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批连翘药材（S7）6份，取按照2.3项下方法平行制备的供试品溶液，分别进样测定。计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.25%，相对峰面积RSD均小于1.48%，表明实验采用方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批连翘药材（S7）的供试品溶液，分别于0、2、4、8、12和24h测定，记录色谱图。考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值。结果显示，共有峰相对保留时间RSD均小于0.39%，相对峰面积RSD均小于1.77%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.5 指纹图谱构建及相似度考察 将所收集的连翘药材样本分别处理，制备供试品溶液，按照2.1项下方法分析测定，得到各样本HPLC图谱，叠加图见图1。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对所获得的样本图谱进行处理，色谱峰自动匹配条件设为：时间窗宽度为0.2s，采用中位数法生成指纹图谱。连翘指纹图谱见图2，其中有共有峰19个。

所获得的不同产地样本HPLC图谱中，14号峰（连翘酯苷A峰）峰面积较大，分离度良好，保留时间适中，故作连翘酯苷A峰为参照物峰。结合参比溶液色谱图，指认出其指纹图谱中4个共有峰。

图1 不同产地连翘药材的色谱叠加图

图2 连翘指纹图谱（A）和参比溶液色谱图（B）（13-连翘酯苷B；14-连翘酯苷A；15-芦丁；18-连翘苷）

表2 20批连翘药材的相似度

以所获连翘药材对照模式为标准，进行相似度计算，结果见表2。由表2可见样品S18、S20与对照模式差异最明显，相似度小于0.9。其他样品与对照模式差异小，相似度大于0.9。2.6 聚类分析 为了直观评价20批样品的质量，采用SPSS 22.0系统软件对样品共有峰峰面积进行聚类分析，采用组间联系法，以夹角余弦作为样品相似性的测度，结果见表3。结果表明，20批样品基本分为两大类。图中显示聚类趋势，阈值底层药材产地较近，随着阈值增加，气候与生长条件接近地区连翘聚为一类。聚类分析结果与中药指纹图谱相似度评价系统计算的相似度结果基本类似，两种方法可以相互验证。

图3 连翘样品聚类分析图

3 讨论

中药指纹图谱是现在常用的中药质量控制方法之一，能反映出中药整体质量信息，体现了中药作用的整体性和模糊性。聚类分析属于化学计量学范畴，能够找到隐藏在众多共性下的差异，对数据进行多元分析[5]。连翘是常用大宗中药材之一，产地多、质量差异大。为建立科学的质量评价方法，我们建立了不同产地连翘药材HPLC-CA指纹图谱分析方法，指认了连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B及芦丁等4个有效成分，通过聚类分析，探讨了不同产地连翘质量的差异。

连翘所含化学成分复杂，药材质量受其所含化学成分影响较大，文献和前期的实验研究均表明，连翘所含成分受采收时间影响较大[2，7]。我们在收集样品时，集中收集8月下旬到9月上旬样品，减少时间差异对样品质量的影响。

聚类分析作为复杂数据处理的方法，对于中药多成分质量控制具有较强的应用价值。本实验中样本聚类分析距离近，说明含有化学成分及比例相似，质量也较接近。聚类远近基本表现为地理、气候等因素差异，可进一步解释中药产地道地性的内涵。聚类分析能够使实验样本分组（分类）情况更加直观地呈现，相似度计算结果呈现的是样品间差异的定性比较，二者配合使用，能够使连翘药材质量标准更加合理，为连翘的临床合理使用提供科学依据。

[1] 阎新佳，温静，项峥，等.连翘的化学成分研究[J].中草药，2017，48（4）：644.

[2] 刘明，王慧森，李更生，等．河南3地区不同采收期连翘果实和叶中多酚类化合物的累积动态研究[J]．时珍国医国药，2017，28（4）：986.

[3] 周磊，杨威，张玉峰.共现矩阵聚类分析的问题与再思考[J].情报杂志，2014，33（6）：32.

[4] 袁会琼，刘江，段宝忠，等.基于HPLC指纹图谱鉴别云南重楼和长柱重楼[J].中成药，2017，39（8）：1670.

[5] 肖榕，林艳，雷思敏，等.UPLC指纹图谱结合模式识别分析不同产地生/制何首乌[J].中国中药杂志，2017，42（12）：2305.

[6] 夏伟，董诚明，杨朝帆，等.连翘化学成分及其药理学研究进展[J].中国现代中药，2016，18（12）：1670.

[7] 裴香萍，张淑蓉，闫艳，等.不同采收期青翘中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量测定[J].中国药事，2011，25（5）：438.