定性与定量评估4种重金属及2种农药混合物对费氏弧菌的毒性相互作用

莫凌云，梁丽营，覃礼堂,* ，秦萌，高欢欢

1. 桂林理工大学环境科学与工程学院，桂林 541004 2. 桂林理工大学，广西环境污染控制理论与技术重点实验室，桂林 541004 3. 桂林理工大学，岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，桂林 541004

在现实环境中，人们和生物体总是同时暴露于多种污染物中[1-4]。且这些污染物往往呈现多组分水平，并产生协同、加和、拮抗等毒性相互作用[5-8]。大量混合物毒性研究表明，相互作用浓度比依赖性及效应水平依赖性是常见现象[9-10]，这就需要研究混合物在不同浓度配比下的相互作用，并利用合理的、易实现的方法来对混合物毒性相互作用进行表征。

毒性相互作用评价方法包括：等效线图、效应相加法、毒性指数法、组合指数[11]、浓度加和(CA)、独立作用(IA)[12]、及模型偏差比(MDR)等。其中，等效线图、效应相加法和毒性指数法是最早提出的评估方法。而现在对于混合物毒性评估及预测，使用频率最高的2个参考模型为CA和IA模型，其中CA模型适用于具有相似作用模式的混合物体系，而IA模型则适用于具有相异作用模式的混合物体系[13-17]。等效线图是通过图形进行定性评估，效应相加法、毒性指数法和组合指数法是通过数值比较进行定性评估；CA和IA可进行混合物毒性的定性评估，而模型偏差比(MDR)可进行混合物毒性的定量评估。MDR是CA或IA预测的效应浓度与拟实验浓度的比值，是比较直观的评估体系[18-19]。通常认为，MDR = 1、>1和<1分别表示加和、协同和拮抗作用。然而，由于实验误差等因素可能使该判断标准导致错误的结论。例如，MDR = 1.1(或0.9)并不能保证混合物产生协同作用(拮抗作用)。因此，在此基础上，采用实验观测值的置信区间(OCI)[20]对毒性实验数据不确定性进行表征更为合理。

随着工农业的发展，重金属和农药在人为或自然因素下的释放，造成了重金属和农药在水环境中普遍共存。由于环境污染物混合的复杂性，即使相同化学物质组成的混合物，其混合比例不同或相同浓度配比的不同浓度水平下，也会产生不同的毒性相互作用[21-22]。为了研究农药和重金属在不同混合比例下的毒性相互作用以及定性和定量表征不同混合比例下的混合物毒性相互作用大小，本研究以费氏弧菌为指示生物，测定2种农药(敌敌畏(DIC)、敌百虫(TRC))和4种重金属(Ni(NO3)2·6H2O[Ni]、ZnSO4·7H2O[Zn]、CdCl2·2.5H2O[Cd]和K2Cr2O7[Cr])构成以等效应浓度比混合的混合物毒性，剖析它们的毒性相互作用。混合物体系包括：农药-农药(DIC-TRC)二元混合、重金属-重金属(Ni-Zn-Cd-Cr)四元混合和农药-重金属(DIC-TRC-Ni-Zn-Cd-Cr)六元混合，应用CA和IA对混合物毒性进行定性评估，结合MDR数值及其95%观测值置信区间进行定量评估其相互作用大小。

1　材料与方法(Materials and methods)

1.1　主要试剂与仪器

Ni(NO3)2·6H2O[Ni](CAS号13478-00-7，纯度≥98.0%)购于广东光华科技股份有限公司；ZnSO4·7H2O[Zn](CAS号7446-20-0，纯度≥99.5%)购于西陇化工股份有限公司；CdCl2·2.5H2O[Cd](CAS号7790-78-5，纯度98.0%)购于damas-beta；K2Cr2O7[Cr](CAS号7778-50-9，纯度99%)购于damas-beta；农药敌敌畏(DIC)(CAS号62-73-7，纯度99.5%)、敌百虫(TRC)(CAS号52-68-6，纯度99%)购于DrEhrenstorfer GmbH公司(德国)。

Synergy 2多功能微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，YXQ-LS-70A型立式压力蒸汽灭菌器(上海医用核子仪器厂)，SW-CF-IFD型洁净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)，Milli-Q超纯水系统(密理博中国有限公司)，Haier药品保存箱(北京利顺航贸易有限公司)，BT25S型五位电子天平(赛多利斯公司)，WZR-D961型微量型振荡器(苏州市东吴医用电子仪器厂)，微板选用96 孔平底不透明聚苯乙烯板(Corning9018)，震荡培养箱(金坛市亿通电子有限公司)。

1.2　菌种与培养

费氏弧菌(Vibrio fischeri)冻干粉(购自北京滨松光子技术股份有限公司)，液体培养基、固态培养基配方及细菌培养方法见文献[22]。

1.3　毒性测试及混合物射线设计

本研究采用微板毒性分析方法[23]，将加好样的微孔板放入Synergy 2多功能微孔板检测仪中，在发光菌与毒物接触时间为15 min时测定其发光强度。为了减少实验误差，提高测量精度，在不同时间、相同条件下，至少进行3次重复实验。发光抑制率的计算公式如下：

(1)

式中I0为空白对照RLU的平均值，I为各浓度3次平行样的RLU平均值。

对于具有一定组成的每个混合物体系，应用等浓度比法设计4条混合物射线(EE-NOEC、EE5、EE10和EE50)，同一条射线中某组分的浓度分数或浓度比(pi)即该组分浓度所占混合物总浓度的分数保持不变。2种农药和4种重金属可构成3个混合物体系为农药二元混合体系(DIC-TRC)、重金属四元混合体系(Ni-Zn-Cd-Cr)、农药与重金属六元混合体系(DIC-TRC-Ni-Zn-Cd-Cr)。每组混合物体系设计4条混合物射线[24]，共设计12条混合物射线，其浓度比例详见表1。

表1　混合物射线浓度比(pi)及拟合参数Table 1　Concentration ratios (pi) and fitting parameters of mixture rays

注：EE-NOEC表示单一物质的NOEC等效应混合；混合物射线EE5、EE10和EE50分别表示单一物质的EC5、EC10和EC50等效应混合。

Note: EE-NOEC is the mixture designed at the NOEC of single compounds; mixture rays EE5, EE10, and EE50are the mixtures designed at the EC5, EC10, and EC50of single compounds.

1.4　浓度-效应曲线拟合

由微板毒性分析方法测定的2种农药和4种重金属以及它们的混合物浓度-效应数据，应用Weibull函数对其进行非线性拟合，Weibull函数见式(2)。

E=1-exp(-exp(α+βlgc))

(2)

式中α和β分别是位置参数和斜率参数，E为效应即发光抑制率，c是单一化合物或混合物浓度。模型拟合优度采用统计量均方根误差(RMSE)和决定系数(R2)表征，RMSE越小，R2越大，说明拟合效果更显著。

通过Weibull反函数，可求得单一化合物或混合物在任意效应下的浓度。在混合物体系设计中，单一物质的EC5、EC10和EC50利用Weibull反函数计算。通过Dunnett检验原理[25]，利用t检验法比较单一物质处理组平均值与实验空白对照组平均值之间的显著性差异，决定处理浓度组是否为NOEC。在本文的毒性测试中，每个毒物由3次重复的12个浓度梯度毒物处理组和1个空白控制组的抑制率数据，构成Dunnett检验数据，计算组间方差、总体方差、组内方差、组内平均值标准差、毒物处理组与空白之间比较之统计量tj，比较各处理组统计量tj与临界值t(通过查t临界值表获得)推算NOEC。NOEC及所有相关计算在化学混合物毒性评估与预测(APTox)方法体系中完成[26]。

1.5　混合物毒性评估

1.5.1定性评估混合物毒性相互作用

通过CA、IA及其混合物浓度-效应曲线95%实验观测值的置信区间(OCI)[20]定性评价混合物毒性相互作用，当CA和IA位于混合物浓度-效应95% OCI上限和下限表示加和效应，低于95% OCI下限表示协同作用，高于95% OCI上限表示协同作用。

CA可以用下面的公式(3)表示[27-28]：

(3)

式中ECx,mix为混合物产生效应x时混合物的浓度(mol·L-1)，ECx,i表示混合物中第i个化合物单独存在时所产生效应x时的浓度(mol·L-1)，pi为混合物中第i个组分的浓度占混合物总浓度的比例。

IA可用公式(4)表示[27-28]：

(4)

式中fi为第i个组分浓度-效应函数，cmix是混合物的总浓度 (mol·L-1)。

混合物浓度-效应曲线的95% OCI定义如下[20]：

(5)

式中α为显著性水平(α=0.05)，t为自由度(n-m)在置信水平为α下的临界值，自由度(n-m)等于22(36-12-2)，可由t分布表查得(t22,0.025= 207 387)，C为由非线性最小二乘回归得到的参数估计值的协方差矩阵，s为观测值标准偏差。

1.5.2定量评价混合物毒性相互作用

为了能够更加准确地评估混合物毒性相互作用，通过MDR及其对应的95% OCI置信区间进行判断。MDR定义为某指定效应下参考模型CA或IA预测的效应浓度(ECx, PRE)与实验浓度(ECx, OBS)的比值[29]。

(6)

式中ECx,PRE通过CA或IA计算，混合物ECx,OBS通过Weibull反函数计算。利用95% OCI ECx,OBS的置信区间上限ECx,上限和下限ECx,下限替代等式(6)中的分子，根据相对模型偏差比(rMDR)置信区间的定义[30]，MDR的置信区间上限(MDR上限)和下限(MDR下限)定义如下：

(7)

(8)

在指定效应下，MDR大于MDR上限时为协同作用，MDR小于MDR下限时为拮抗作用，MDR位于MDR上限和MDR下限之间为拮抗作用。

2　结果与讨论(Results and discussion)

2.1　单一重金属及农药毒性

微板毒性分析法测得4个重金属及2个农药对费氏弧菌的浓度-效应曲线(CRC)如图1所示，采用Weibull函数进行拟合得到相关参数及NOEC(通过Dunnett检验获得)、EC5、EC10与EC50见表2。由图1和表2可知拟合结果良好，TRC的毒性(pEC50=2.08)比Cd(pEC50=4.23)的毒性小了2个数量级。以pEC50作为标准，其毒性大小顺序为：Cd > Zn > Ni > Cr> DIC > TRC。

2.2　农药-农药混合毒性

DIC-TRC二元混合物体系各射线的拟合参数(α和β)及统计值(R2和RMSE)与pEC50值等列于表1。从表1可以看出，DIC-TRC混合物体系的毒性随着DIC的浓度降低而有所降低。

各混合物射线对费氏弧菌的浓度-效应(数据点)、观测置信区间及CA与IA模型曲线结果列于图2，混合物射线EE-NOEC、EE5和EE10的CA和IA预测结果明显偏离实验数据点，呈现明显的协同作用。混合物射线EE50在低浓度区域呈加和作用，高浓度为弱协同作用，明显小于混合物射线EE-NOEC、EE5和EE10的协同作用。因此，这说明同一混合物体系中不同浓度比的混合物射线毒性相互作用不一样。

图1　6个化合物对费氏弧菌的剂量-效应关系Fig. 1　Dose-response relationships for 6 compounds to Vibrio fischeri

图2　农药二元混合物对费氏弧菌毒性的CRC及CA和IA预测结果注： “·”为实验数据点，“--”表示95%实验观测值置信区间。Fig. 2　The CRCs of acute toxicity of binary mixture of pesticides to Vibrio fischeri and the CA and IA predictionsNote: “·” is the experimental data, “--” is the observation-based confidence interval.

化合物CompoundαβR2RMSE效应浓度/(mol·L-1)Effectconcentration/(mol·L-1)NOECEC5EC10EC50EC50置信区间ConfidenceintervalNi10.373.520.99540.02687.39E-051.62E-042.60E-048.91E-047.74E-04～1.04E-03Zn6.311.730.91520.10001.75E-054.32E-061.13E-051.39E-044.00E-05～3.86E-04Cd10.002.450.99630.02455.44E-065.08E-061.00E-055.87E-054.93E-05～7.14E-05Cr5.171.870.99660.01284.23E-054.44E-051.08E-041.10E-039.82E-04～1.26E-03DIC12.705.900.99830.01811.47E-032.21E-032.92E-036.10E-035.47E-03～7.12E-03TRC2.851.550.99690.01332.23E-041.76E-045.12E-048.41E-037.22E-03～9.58E-03

基于95% OCI的MDR方法定量表征DIC-TRC混合物体系在10%～90%效应范围的相互作用列于图3。从MDR及其95%OCI随效应x%的变化可知混合物射线EE-NOEC、EE5、EE10的MDR值均在置信区间的上方，呈现出明显的协同作用。最大协同作用发生在低效应和低浓度区域，随着效应及混合物浓度增加，协同作用大小逐渐减弱。混合物射线EE-NOEC在10%效应下的MDRCA和MDRIA分别为58.43和70.24(MDR下限=0.68，MDR上限=1.37)，在50%效应下协同作用大小达到30.6(MDRCA和MDRIA数值)。混合物射线EE5、EE10的协同作用大小接近于混合物射线EE-NOEC。混合物射线EE50的10%效应的MDR值位于95%OCI下限和上限，例如在5%效应下，混合物MDRCA=1.02和MDRIA=1.08在95% OCI下限(MDR下限=0.47)和上限(MDR上限=1.57)之间，表明混合物在该效应下为加和效应。混合物射线EE50的效应大于15%时CA和IA计算的MDR值均在置信区间上限的上方，即混合物发生协同作用，且协同作用最大发生在40%效应下，MDRCA和MDRIA分别为1.96和2.46，均大于95%OCI上限(MDR上限=1.10)。

混合物组分之间的协同作用与组分浓度、暴露时间和指示生物等多种因素有关。对于DIC-TRC二元混合物体系对费氏弧菌的急性毒性，相同混合物射线(相同浓度比例)在不同的浓度范围的协同作用大小发生明显变化，不同浓度比例的混合物射线的协同作用也不同。因此，混合物浓度及组分的浓度比例是相互作用的主要影响因素之一。

2.3　重金属-重金属混合毒性

重金属Ni-Zn-Cd-Cr四元混合物体系的拟合参数(α和β)、统计值(R2和RMSE)、pEC50值及混合物浓度比例等列于表1，从表1可以看出每条混合物射线所含重金属含量不同，其混合物的毒性没有明显差异，pEC50值为3.22～3.46。图4给出Ni-Zn-Cd-Cr重金属混合物体系的4条混合物射线对费氏弧菌的浓度-效应数据、95%OCI及CA和IA模型预测结果。从图4可以看出3条混合物射线EE-NOEC、EE5和EE10的CA和IA预测结果位于95%OCI下限和上限之间，表明混合物为加和效应。混合物射线EC50的CA和IA预测结果在95%置信区间上限的上方即为拮抗作用。图5给出四元混合物体系的MDR图，3条混合物射线EE-NOEC、EE5和EE10的MDR值均在95%OCI下限和上限之间，为加和效应。混合物射线EE50的MDR值位于95%OCI下限的下方，为拮抗作用。混合物表现出拮抗作用则意味着该组混合物中，起决定作用的组分在对费氏弧菌致毒过程中出现了不同的毒性效应或者类似竞争作用位点的可结合性的降低，从而减弱了对方的毒性。

图3　基于CA和IA模型的农药二元混合物MDR值Fig. 3　The MDR value of binary pesticide mixture based on CA and IA models

图4　重金属四元混合物对费氏弧菌毒性的CRC及CA和IA预测结果Fig. 4　The CRCs of acute toxicities of mixtures of four heavy metals to Vibrio fischeri and CA and IA predictions

图5　重金属四元联合效应下CA和IA模型的MDR值Fig. 5　The MDR values of four-component joint effect of heavy metals based on CA and IA models

2.4　农药-重金属混合毒性

农药-重金属六元混合物体系的拟合参数(α和β)、统计值(R2和RMSE)与pEC50值等列于表2，并将模拟曲线与实验测定的CRC数据散点图绘于图6所示，由CA和IA模型计算的MDR值如图7所示。从图6中可以看出，通过CA与IA定性评估农药-重金属六元混合物体系的毒性，4条混合物射线EE-NOEC、EE5、EE10和EE50实测CRC在整个浓度区间均高于CA和IA预测结果，呈协同作用。从图7中可以看出，4条混合物射线EE-NOEC、EE5、EE10、EE50的MDR值均在置信区间上限的上方，呈现出明显的协同作用。在50%效应下，混合物射线EE-NOEC、EE5、EE10和EE50的MDRCA和MDRIA值分别为4.05和4.91(MDR下限=0.87，MDR上限=1.13)、6.12和7.98(MDR下限=1.42，MDR上限=1.83)、3.70和4.60 (MDR下限=0.88，MDR上限=1.14)、2.62和2.59(MDR下限=0.92，MDR上限=1.09)。因此，该六元混合物体系的协同作用大小随着组分浓度变化而变化。出现协同作用的原因，是由于2种农药与4种重金属共同存在时，细菌的细胞膜通透性增强，污染物更容易入进去到细胞内与酶进行反应，导致发光减弱，对细菌的毒性也就增强[31-32]。

从以上结果可知，四条DIC-TRC二元混合物射线不同浓度水平对费氏弧菌的急性毒性中，除了EC50比混合物射线为弱协同作用外均有非常显著的协同效应。四元重金属混合物体系中，除了混合物射线EE50具有弱的拮抗作用外均为加和作用。在六元农药-重金属混合物体系中，4条混合物射线均表现出不同的协同作用，且协同作用大小在10%～90%效应范围呈现减弱的趋势，该趋势与DIC-TRC二元混合物体系的结果相似。因此，二元混合物(MDRCA和MDRIA大于60)的协同作用明显大于六元混合物(MDRCA和MDRIA小于8)。污染物之间的协同作用与组分浓度配比和混合物浓度密切相关。

图6　重金属与农药六元混合物对费氏弧菌急性毒性的CRC及CA和IA预测结果Fig. 6　The CRCs of acute toxicities for six components mixtures of heavy metals and pesticides to Vibrio fischeri and CA and IA predictions

图7　基于CA与IA模型的重金属与农药六元混合物MDR值Fig. 7　MDR values for six components mixtures of heavy metals and pesticides based on CA and IA

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