快速检测技术在酱油发酵中微量乙醇含量测定的应用改进

莫允焕，薛健长，曾小波

(李锦记(新会)食品有限公司，广东 江门　529156)

目前，对于微量乙醇的测定主要以气相色谱法为主，但检测仪器投入大，检测成本高，制约了此方法的广泛应用。重铬酸盐氧化分光光度法测定微量乙醇含量，是一种快速、准确的测定方法，它具有操作简便、所需分析仪器简单的特点，尤其适用于生产和质检部门的日常分析。而随着科技的发展，更多的检测仪器、检测手段的应用，是否有更快捷、更简单的检测方法呢？

在《中国药典2005版一部》附录Ⅸ M 乙醇量测定法Ⅱ中提及了蒸馏法的测定，是对样品进行蒸馏后获得乙醇馏出物进行相对密度的测定，从而折算出乙醇的含量[1]。此方法在应用仪器、检测步骤、检测时间上具备优势，符合企业生产检测需求。

1　材料和方法

通过气相色谱法(第一法)、重铬酸盐氧化分光光度法、蒸馏测量相对密度法测量发酵酱油中微量乙醇含量的实验过程和数据结果，得出企业实际应用的最优检测方案。

1.1　材料和试剂

典型广式酱油和日式酱油：由李锦记(新会)食品有限公司提供。

乙醇(无水乙醇)：广州化学试剂厂。

1.2　仪器和设备

GC-2010 Plus气相色谱仪日本岛津公司；紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；凯氏定氮仪德国福斯分析仪器公司；DMA4500M密度计奥地利安东帕公司；电炉、电磁炉、蒸馏回流设备、容量瓶等常用实验室仪器厂家。

1.3　方法

1.3.1气相色谱法测定乙醇含量

气相色谱法应用范围广，国家标准已将气相色谱法列为啤酒、葡萄酒、果酒中酒精度的测定方法之一[2,3]；气相色谱法测定药酒中的乙醇量[4]；气相色谱法测定果蔬汁饮料、含乳饮料中的乙醇含量[5]；气相色谱法测定消毒剂中的乙醇含量[6]；中国药典中酒精度的测定已将气相色谱法列为第一分析法。

气相色谱法测定乙醇含量主要应用外标法定量。用欲测组分的纯物质加稀释剂(对液体试样用溶剂稀释，气体试样用载气或空气稀释)配制成不同质量分数的标准溶液，取固定量标准溶液进行分析，从所得色谱图上测得相应信号(峰面积或峰高)，然后绘制响应信号(纵坐标)对质量分数(横坐标)的标准曲线，见图1。分析时，取和绘制标准曲线时同样量的试剂(固定量进样)，测得该试样的响应信号，由标准曲线即可查出其质量分数[7]。

图1　气相色谱乙醇浓度标准曲线Fig.1 Standard curve of ethanol concentration by gas chromatography

用外标法进行定量具有不使用校正因子、操作简单、计算方便等优点，但是这种方法结果的准确度主要取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性，且检测仪器(色谱仪)投入大，检测成本高。

1.3.2分光光度法测定乙醇含量

重铬酸盐氧化分光光度法测定微量乙醇含量，是一种快速、准确的测定方法，它具有操作简便、所需分析仪器简单的特点，适用于生产和质检部门的日常分析。

在酸性溶液中，乙醇可被重铬酸氧化生成乙酸，重铬酸钾中的六价铬被还原成三价铬，其反应式为：

3C2H5OH+2K2Cr2O7+8H2SO4=3CH3COOH+2K2SO4+2Cr2(SO4)+11H2O。

反应中生成的三价铬为绿色，它在585 nm处有最大吸收峰，且溶液颜色的深浅与乙醇含量成正比，可以在分光光度计上比色，通过与标准系列比较进行定量[8,9]。

取6支25 mL A级比色管，各加入1 mL重铬酸钾溶液和5 mL浓H2SO4，混匀，并冷却，依次加入表1中的溶液。

表1　标准溶液配制Table 1 The preparation of standard solution

摇匀，于沸水浴中保温发色10 min，取出冷却至常温，于600 nm波长处分别测定其吸光度，绘制标准曲线，测得的结果见表2。

表2　标准溶液对应吸光度Table 2 The absorbance of standard solution

由表1和表2绘制成标准曲线，见图2。

图2　分光光度法乙醇浓度标准曲线Fig.2 Standard curve of ethanol concentration by spectrophotometry

取50 mL 样品置入500 mL圆底烧瓶中，加150 mL蒸馏水，连接好冷凝装置(检查出水管是否畅通，保证冷却水进出自如)后蒸馏，用50 mL容量瓶(接收容量瓶用冰粒冷却)准确接收馏出液50 mL，摇匀。根据样品大概酒精含量以倍数(N)稀释馏出液(0～0.1%不稀释；0.1%～1% 稀释10倍；1%～10%稀释50倍；10%～30%稀释100倍)。吸取5 mL稀释液置入25 mL比色管中，加 1 mL 2%重铬酸钾溶液、5 mL浓硫酸，摇匀，于沸水浴中保温发色10 min，取出冷却。600 nm波长处分别测定其吸光度，代入标准曲线方程求得乙醇含量。

用分光光度法进行定量的测定方法具有操作简便、所需分析仪器简单的特点。但是这种方法结果容易受试剂变化所影响，因此每次新配试剂均需重新制定标准曲线，且检测时间相对较长[10]。

1.3.3蒸馏法测定相对密度换算成乙醇含量

以蒸馏法去除样品中的不挥发性物质，再测量馏出液的相对密度，换算成乙醇含量[11-14]。

1.3.3.1蒸馏

依照分光光度法测定的蒸馏步骤，使用蒸馏瓶连接冷凝装置接出馏出液，见图3。

图3　蒸馏装置Fig.3 Distillation apparatus

使用凯氏定氮蒸馏仪，设定100 ℃，3 min，接出馏出液，见图4。

图4　凯氏定氮蒸馏仪Fig.4 Kjeldahl distillation apparatus

1.3.3.2相对密度

其原理是通过仪器内部的U型振荡管密度计测量馏出液密度后换算成乙醇浓度，见图5。

图5　安东帕DMA4500MFig.5 Anton Paar DMA4500M

其中蒸馏方法①操作步骤多，玻璃仪器连接的气密性对最终结果影响较大，相对时间长(约45 min/样)；蒸馏方法②时间短(仅3 min)，且操作步骤少，可相应减少检测过程误差的产生。在尝试蒸馏方法②时，乙醇标准液回收率检测合格。但检测我公司产品时，沸腾后会产生很多泡沫，溢出蒸馏罐，造成检测结果的误差。通过一系列尝试，最终添加少量单硬脂酸甘油酯(食品级消泡剂)可避免此现象。

2　结果和分析

2.1　方法有效性验证

气相色谱法和分光光度法均收录在国标检测方法中，则此两种方法不做相关回收率验证。主要对蒸馏测相对密度法进行回收率验证，用标准溶液验证。计算仪器引起的偏差和检测方法的偏差，以判断方法的可行性，验证数据见表3。

表3　标准溶液回收率结果Table 3 Recoveries of standard solution

再依据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中关于回收率范围的规定[15]，见表4。

表4　回收率范围Table 4 The recoveries range

得出结论：配制浓度为0.1%的样品检测偏差超出回收率许可范围，即此方法不适用于0.2%以下乙醇含量的样品检测。而0.2%标准溶液检测结果的仪器和检测方法偏差均较大，还需进一步验证。

进行重复试验以考察该方法的最低检测限和方法的稳定性，数据见表5。

表5　最低检测限和稳定性验证Table 5 Minimum detection limit and stability verification

再依据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中关于测定值与真值的偏差指导范围的规定，见表6。

表6　测定值与真值的偏差指导范围Table 6 Range of deviation between measured value and true value

配制浓度为0.5%以下的样品检测偏差超出偏差许可范围，即此方法不适用于0.5%以下乙醇含量的样品检测。0.5%以上的结果偏差符合要求且稳定性较好。

最后进行实际应用验证(发酵酱油产品加标回收)，具体数据见表7。

表7　加标回收测试Table 7 The recovery rate

同时考虑常规发酵酱油产品乙醇含量在1%～3%之间，因此该方法符合发酵酱油检测无水乙醇的要求。

2.2　三种检测方法的对比

2.2.1检测成本对比

方法一仪器投入成本高，检测时间长，每日(以8 h算)样品处理量约6～8个；方法二仪器投入成本不高，且所用仪器(蒸馏设备、分光光度计等)为日常酱油检测所用仪器，操作简便。但是这种方法结果容易受试剂变化所影响，因此每次新配试剂均需重新制定标准曲线，且检测时间相对较长，每日样品处理量约20～30个；方法三仪器简单，所用仪器(蒸馏设备、比重计等)为日常酱油检测所用仪器。不需消耗化学试剂，每日样品处理量约40～60个。

2.2.2检测结果精密度对比

使用三种方法对相同样品进行检测对照，以气相色谱法(第一分析法)检测的样品结果作为标准结果对分光光度法和蒸馏测相对密度法的结果进行比对，判断后面两种方法的精确度，结果见表8。

表8　结果对比Table 8 The results of comparison

由表8可知，蒸馏测相对密度法所得的样品乙醇含量与气相法所测结果较接近。

3　结论

微量乙醇的测定方法在我公司检测样品应用的发展，由最初气相法测定的样品检测周期长、检测成本高，优化到分光光度法检测。而分光光度法检测的操作步骤多、相对误差大，最终开发应用了蒸馏测相对密度法。相比之下每次的方法改进都比之前的检测更快捷方便，降低了检测成本。同时，新方法的开发使用必须经过严谨的验证。

其他检验方法在日常应用中也要与时俱进，食品检验人员必须具备相关学习应用和优化检验方法的技能。

参考文献：

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[2]GB/T 4928-2008,啤酒分析方法[S].

[3]GB/T 15038-1994,葡萄酒、果酒通用试验方法[S].

[4]靳春林,张宏志.毛细管柱气相色谱法快速测定药酒中的乙醇量[J].山东化工,1998(5):41-43.

[5]谢勇,刘晓宇.气相色谱法测定饮料中乙醇含量[J].分析测试技术与仪器,2002,8(1):56-58.

[6]董仕林,胡家英,周勤文,等.国家标准——消毒剂中乙醇含量测定方法[J].安徽预防医学杂志, 2001,7(4):252-254.

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[8]王兴红,江东福,马萍,等.低含量乙醇的简便测定方法[J].生物学杂志,1995(3):28-29.

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[15]GB/T 27404-2008,实验室质量控制规范 食品理化检测[S].