泛素蛋白酶体途径和泛素羧基末端水解酶-3及其参与调节生物进程的研究进展

任国婧，师永红 ，2

（1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学附属医院病理科，内蒙古 呼和浩特 010050）

泛素是一个有大约8 KD分子量的小蛋白，其与靶蛋白的特异性结合称为泛素化作用。泛素化是转录后的编辑，参与细胞的各种生物进程，蛋白的泛素化和去泛素化的过程在多种疾病的发生过程起重要作用包括信号转导和维持蛋白的稳定、细胞的生长、分化、凋亡等并参与肿瘤的形成演进[1]。泛素蛋白酶体系统（UPS）作为蛋白降解的途径，对依赖此途径降解的蛋白具有高度选择性，泛素化的异常蛋白质和短寿蛋白质能被26S蛋白酶体识别并降解[2]。此途径又称ATP-依赖降解途径在细胞周期、DNA复制、免疫应答等生物过程中扮演重要角色。去泛素化酶（DUBs）可以逆转蛋白的泛素化，将蛋白从泛素分子上分离开来，可以避免蛋白的过度降解并重新释放出泛素单体，使泛素重新进入泛素蛋白酶体的循环[3]，对于调节生物体内蛋白的平衡起重要作用。

1 泛素与蛋白酶体降解体系

1.1 泛素与泛素化过程 泛素分子是存在真核生物细胞中由76个氨基酸分子组成的一个有大约8 KD分子量的小蛋白。泛素分子的主要特征是其含有的7种甘氨酸（Lys）残基（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）均能被泛素化产生相应的泛素与异肽链接的环状链；当泛素被连接到第二个泛素的氮-末端时，产生了第八种链型即蛋氨酸1-链（Met-1）或“线性”链。同时，泛素也可以在甘氨酸（Lys）残基上被乙酰化，或者在丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）残基上磷酸化[4]，泛素分子每一个修饰都有可能极大地改变生物信号输出结果。泛素与靶蛋白的特异性结合称为泛素化作用。泛素化的编辑大体分为三个过程，首先是泛素分子被泛素激活酶E1激活，此过程需要分解ATP提供能量；其次有活性的泛素分子与泛素结合酶E2结合，最后在泛素蛋白连接酶E3的作用下将靶蛋白与E2s结合的泛素羧基末端连接，使靶蛋白被泛素-蛋白酶体识别并降解，其中决定蛋白特异性结合的酶是E3s[5]。一种蛋白质的降解需多次泛素化反应，形成泛素化链。蛋白的泛素化是一种动态的多层次的转录后的编辑，几乎涉及真核生物的所有生物行为，包括生物信号转导、细胞周期、细胞凋亡和肿瘤的形成与演进等。

1.2 泛素化与蛋白酶体降解体系 在真核细胞中蛋白质的降解有两条重要的途径，一条途径是降解细胞外来的蛋白质、膜蛋白和细胞内长寿蛋白的溶酶体或者液泡自噬，其对蛋白的特异性较差，其他细胞内的物质如核酸、脂质和碳水化合物等均可通过此途径被人体消化；另一条途径是通过蛋白酶体途径来降解异常蛋白质和短寿蛋白质，此途径对要降解的目标蛋白有较高的选择性，其对蛋白的降解是通过泛素化编辑作用来进行的[6]。蛋白酶体是26 S的蛋白质复合物，主要由20 S的核心颗粒和19 S或11 S的调节颗粒组成。核心颗粒是由2个α外环和2个β内环组成，每个环又由7个亚基构成。核心颗粒的α环在氮-端的中心轴形成一扇门以阻挡分子进入核心颗粒内。核心颗粒是蛋白酶体的水解核心，活性位点位于2个β环上，其中β1、β2和β5亚基具有蛋白酶活性，可分别裂解含半胱氨酸的天冬氨酸特异性酶活性、胰蛋白酶相似活性、糜蛋白酶活性的底物，催化不同的蛋白质降解。调节颗粒位于核心颗粒的两端，形成空心圆柱的盖子，其能识别，结合待降解的泛素化蛋白并与蛋白质的去折叠及使蛋白质定位于20 S的核心颗粒有关[7]。泛素化的蛋白质被26 S的泛素蛋白酶体识别并在泛素蛋白酶体降解，产生一些约7～9个氨基酸残基组成的肽链，肽链进一步水解生成氨基酸残基。

1.3 泛素化降解的底物蛋白及参与的生物过程 UPS是具有高度选择性的蛋白降解系统，许多基因的蛋白均通过此途径降解，影响生物的进程。巨噬细胞活化因子c（c-Maf）的过表达被认为是多发性骨髓瘤的显著标志，在多发性骨髓瘤中c-Maf蛋白的水平显著下降且出现骨髓瘤细胞凋亡，近期研究发现泛素连接酶UBE2O能下调c-Maf的活性及细胞周期蛋白D2的表达，恢复细胞中UBE2O活性其能与c-Maf形成Lys48-多聚泛素化链（K48）并使c-Maf降解，诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长[8]。清道夫受体B型1（SR-B1）属于巨噬细胞受体的一种，在细胞的新陈代谢中有多重作用，包括促进度脂蛋白胆固醇脂（HDL-CE）选择性分解、调节高密度脂蛋白的代谢、抗炎作用，还能促进维生素分子、病毒及凋亡细胞的吸收分解。SR-B1通过蛋白酶体途径降解，NHERF1（Na+/H+exchanger regulatory factor-1）和NHERF2（Na+/H+exchanger regulatory factor-2）能分别促进SR-B1的甘氨酸-508和甘氨酸-500位点的泛素化促使其被泛素蛋白酶体识别并降解，减少SR-B1蛋白的水平，抑制SR-B1的作用[9]，增加疾病的风险。作为一种翻译后编辑，泛素化的蛋白在炎性细胞中有重要作用。丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）亚家族p38α介导炎症、凋亡等应激反应，成为开发抗炎药物的靶位。Nedd4属于泛素蛋白连接酶E3家族，有E3的活性特点，研究表明沉默Nedd4的表达或者敲除Nedd4的基因，细胞中磷酸化的p38水平增高，磷酸化的p38α（p-p38α）在p38α和Nedd4之间的泛素连接尤其是以甘氨酸-48链（K-48）的多聚泛素化连接中有重要作用，能促进p38α亚型（p38αV1和p38αV2）降解。同样p38和Nedd4的K-48和K-63连接也能诱导p-p38α通过蛋白酶和溶酶体途径的降解。Nedd4还可以通过调节p-p38α的降解抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）和激活蛋白-1（AP-1）的活性，为炎症的靶向治疗提供更多的方向[10]。透明质酸酶配体（PCB-126）能增加肿瘤抑制基因（P53）的泛素化及其通过泛素蛋白酶体降解过程来抑制P53的表达，减少游离泛素单体，扰乱泛素蛋白酶体降解平衡，为肿瘤的治疗提供可能靶点[11]。

2 去泛素化酶体系的作用

2.1 去泛素化酶家族及作用机理 去泛素化酶可以逆转蛋白的泛素化，将蛋白从泛素分子上分离开来，并重新释放出泛素单体，使之进入泛素蛋白酶体的循环。依据基因序列和组织结构的相似性，去泛素化酶家族又分为6个亚家族，包括羧基末端水解酶家族UCHs、卵巢肿瘤相关蛋白OTUs、泛素特异性蛋白酶USP、MJD酶（含Machado-Joseph结构域）以及单核细胞趋化蛋白诱导的蛋白质家族（MCPIP）和JAB1/MPN/MOV34蛋白酶家族（JAMMs），其中泛素羧基末端水解酶家族UCHs属于半胱氨酸水解酶家族是最先被人们研究并加以说明的[12]。人体UCHs家族种类众多，包含UCH-L1、UCH-L3、UCH-L5（UCH37）、BAP1等，家族成员在氨基酸序列上有很大的相似性如UCH-L3与UCH-L1有超过55%的相似的氨基酸序列，UCH-L5与UCH-L3和UCH-L1分别有超过28%和23%氨基酸片段相同，在其中起主要作用的是UCH-L1和UCH-L3[13]。

泛素羧基末端水解酶-3作为UCHs中的起主要作用的成员，其结构和功能越来越多被人们所了解。UCH-L3有C-末端水解酶活性，能作用于泛素的羧基端将泛素上结合的小分子的肽和化合物水解为泛素单体和结合物，其通过形成Lsy48-和Lsy63-结合泛素二聚体来防止靶蛋白的降解和抑制泛素化活性[14]。研究发现UCHs家族不能水解泛素二聚体（Ub-Ub dimers），但是UCH-L3、UCH-L1、UCH-L5和BAP1可以通过直接水解Ub-SUMO2和Ub-Ube2W等泛素结合肽形式的结构蛋白N-端结合的泛素释放出自由的泛素单体和结合蛋白[15]。UCH-L3的水解活性与每个结合蛋白底物的热稳定性有很大的关系，底物的热稳定性可以影响UCH-L3对底物的特异性选择，使其有可能裂解更大更稳定的蛋白底物[16]。

2.2 UCH-L3调节的靶蛋白及参与的生物学过程

2.2.1 UCH-L3与细胞的侵袭转移 上皮-间质转化（EMT）在肿瘤发生发展进程及侵袭转移中起重要作用，其表达上调可以减少上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）的表达，破坏细胞间的连接，使上皮细胞极性丧失，增加肿瘤细胞的侵袭和转移[17]。研究表明UCH-L3可以通过调节EMT现象进而调节肿瘤的生物学行为。在不同类型的前列腺癌细胞中UCH-L3的表达水平不同其表达上调在正常或非转移性前列腺癌细胞，下调在高度转移性前列腺癌细胞如PC3细胞和DU145细胞。敲除人正常前列腺上皮细胞1（RWPE1）的UCHl3基因，可以诱发EMT现象的形态学变化和相关因子表达的改变，如上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）表达下调及Snail、Slug、Twist、和MMPs的增加，进而促进细胞的侵袭和转移。而增加高度转移性前列腺癌PC3细胞中UCHL3的表达，可以逆转EMT现象的发生，并且减少癌细胞的侵袭和转移[18]。此外肿瘤的转移与多种因子相关，包括过氧化氢酶、过氧化物、低氧诱导因子等能促进肿瘤的侵袭和转移。UCH-L1可以通过水解过氧化氢酶NOX4蛋白含有赖氨酸残基结构使其去泛素化增加NOX4的活性，提高细胞中过氧化氢酶的水平，增加细胞的侵袭和转移[19]。敲除UCH-37基因能抑制TGF-β通路诱导的细胞侵袭和转移，但是不能影响TGF-β通路调控的细胞周期、生长和EMT现象[20]。

2.2.2 UCH-L3与细胞凋亡 肿瘤的生长，取决于细胞的增殖与细胞死亡的比例。有研究表明泛素化是调节众多细胞凋亡机制中重要的途径，许多凋亡相关因子例如P53、Bcl-2家族、Caspase家族蛋白酶等是通过泛素化来调节细胞的凋亡。细长轴突萎缩症（gad）鼠，其体内UCH-L1缺乏、泛素化的水平减少且能抵抗隐睾病对其损伤的压力，但是检测发现患有隐睾病的gad鼠体内的抗凋亡分子Bcl-2家族的Bcl-2、Bcl-Xl和XIAP水平以及促进生长的分子磷酸化环腺苷酸反应序列结合蛋白（pCREB）和囊源神经营养因子（BDNF）显著增高，但是其凋亡抑制蛋白Caspase家族表达受抑制。相反的是，UCH-L3敲除的鼠患隐睾病后发现其睾丸萎缩并且促进凋亡基因P53、Bax、Caspase3的表达显著增加。表明UCHL1在调节凋亡和抗凋亡之间的平衡起重要作用，并在精原细胞的生长和精子的发生中扮演重要角色，UCH-L3显著的减少生殖细胞凋亡[21]。与UCH-L3序列高度相似的UCH-L1主要存在于神经元细胞中。在有肥胖症大鼠的大脑皮层，UCHL1和UCH-L3的表达上调，上调的UCH-L1可能使P53基因稳定表达并通过P53影响Bax及Caspase3的作用诱导细胞凋亡或触发内质网应激启动蛋白激酶R类似内质网激酶（PERK）、转录激活因子6（ATF6）和X-盒结合蛋白1（XBP1）通路导致神经细胞死亡[22]。

2.2.3 UCH-L3与DNA修复 同源重组（HR）是由通过BRCA2-RAD51轴由BRCA2引入DNA双链断裂的蛋白质RAD51引导的同源链交换，是哺乳动物细胞DNA双链断裂修复的主要方式之一。HR的缺失会导致基因组的不稳定，也是肿瘤发生的诱因[23]。研究发现UCH-L3能使RAD51去泛素化并促进BRCA2和RAD51之间的连接。认为UCHL3是DNA修复的新型调节因子，并通过其中的一个模型磷酸化-去泛素化级联动态调节BRCA2-RAD51途径来实现DNA修复。过表达UCHL3的乳腺癌细胞耐辐射和化疗，而UCHL3的缺失使细胞对这些治疗敏感，这表明了UCHL3在癌症治疗中决定性作用[24]。为乳腺癌的靶向治疗提供了新的靶点。

2.2.4 UCH-L3与其他生物进程 新的研究发现泛素羧基末端水解酶家族与精子的发生和受精过程有很大的联系，UCH-L3表达水平对精子的数量、浓度及运动能力产生积极影响，且研究发现UCH-L3在弱精子症和少弱精子症的水平明显低于精子量正常的水平，其可以作为检验弱精子症和少弱精子症患者的精子质量、受精及早期胚胎发展的指标[25]。研究人员发现提高UCH-L3的表达水平能诱导骨形成蛋白2（BMP2）启动转录因子Smad1和调节下游基因的转录，增加Smad1的稳定性，显著促进成骨细胞的分化，减少UCH-L3的水平能影响丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK），进而影响软骨的形成导致面部畸形[26]。

2.3 展望 近年来，随着对去泛素化酶家族研究的深入，泛素羧基末端水解酶-3作为去泛素化酶家族主要成员也受到人们的广泛关注，但是目前对于UCH-L3的研究还不太充分，尚有问题亟需解决：①UCH-L3参与细胞周期的具体途径；②UCH-L3的去泛素化作用已经明确，但是具体的切割位点还要进一步研究；③UCH-L3的表达与肿瘤细胞的转移相关，但是相关实验和临床资料太少，现有研究未明确UCH-L3与肿瘤转移方式的关系；④UCH-L3表达水平的改变可以使凋亡蛋白的表达水平发生变化，UCH-L3调节细胞凋亡的具体信号转导通路和蛋白通路尚不明确等。因此，对UCH-L3参与调节生物活性机制的研究还应该在其具体的去泛素化位点及参与的信号通路和蛋白通路方向继续深入，以便为疾病的靶向治疗提供更多的理论支持。

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