基因芯片研究针刺人迎穴对SHR主动脉弓基因表达的影响

马 田，郭 妍，芦 娟，赵瑞利，LIM ANNA，石学敏，郭长青*

（ 1.北京中医药大学,北京 100029；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

原发性高血压病（EH）的主要临床表现为血压升高，常伴发心、脑、肾等靶器官功能性和（或）器质性病变[1]，近年来其患病率、致残率、致死率居高不下，且绝对和相对发病率均有增多的趋势[2]。EH的发生发展过程中靶器官损害的共同病理学基础——血管重构（VR）起着至关重要的作用。 VR既是高血压重要的病理变化，又是高血压维持、恶化的结构基础，随着学者对细胞外基质受体相互作用通路（ECM-receptor interaction pathway）研究的不断深入，发现其在高血压血管重构中起到十分重要的作用[3]。作为公认的与人类EH最相似的动物模型，自发性高血压大鼠（SHR）在目前EH实验研究中最为常用[4-5]。心血管系统疾病属于与多基因位点变异和表达异常有关的复杂性疾病，传统的单因素检测方法已不能满足研究需求，需要更先进的检测技术来实现对心血管系统疾病的研究[6]。基因芯片技术可一次性平行分析数以万计个基因mRNA表达情况，同时可检测到信号转导网络中多个节点的基因的信息表达，可更好地满足心血管系统疾病研究的需求[7-9]。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SHR 20只，Wistar Kyoto（WKY）大鼠10只，清洁级，雄性9周龄，体质量180～200 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号： SCXK（京）200223。用笔在SHR尾部标记序号，并按照 EXCEL 随机数字表法将20只SHR随机分为模型组、人迎组，每组10只；10只WKY大鼠作为空白组。

1.2 器材与仪器 器材：中研太和牌一次性无菌针灸针：0.16 mm × 7 mm（ 购自北京中研太和医疗器械有限公司）；手术器械、凝胶促凝管（ 购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司）；冻存管（购自北京康晖煜科技有限公司）；EP 管(购自北京健力园医疗器械有限公司）。仪器： 小动物断头器（购自北京硕林苑科技有限公司），动物无创血压仪（型号：BP - 6）、电子天平（型号： ER - 182A）。

1.3 针刺穴位选取 针刺“人迎穴”。《实验针灸学》教材取穴：在颈部三角区内，当胸骨舌骨肌与胸锁乳突肌上缘交点，约为颈总动脉分叉处，体表可触及搏动。参照文献[10]取大鼠颈前两侧下颌骨隅突连线下8 mm，前正中线旁开3.5 mm。

1.4 针刺操作 人迎组：将大鼠束缚于自制鼠套中，露出颈部，以右手为刺手，取双侧“人迎穴”，针灸针直刺 4～5 mm。刺入后以针体微微颤动为准，行捻转平补平泻法1 min，留针19 min。每天中午12:00治疗1次，每针刺6 d休息1 d，共针刺4周，所有针剌操作均由同1人完成。模型组与空白组：将大鼠束缚于自制鼠套内20 min，不做任何干预。

1.5 血压测量 在针刺干预第1、5、9、13、 17、21、25、28天测量各组大鼠尾动脉收缩压。每只大鼠测量3次并取平均值；动作轻柔避免激惹引起大鼠的血压波动；加温时间要控制在15 min以内，避免高温导致大鼠死亡；鼠套和尾套尺寸合适，周围无噪声，环境温度恒定。应用 SPSS 20.0软件进行统计数据处理。计量资料以均数±标准差（）表示。各组间差异采用单因素方差分析。P ＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

1.6 实验取材 各组大鼠麻醉状态下立即处死并取材，取主动脉弓处约2～3 mm主动脉一段，将残留的结缔组织剥离干净，漂洗后用滤纸吸干水分放入冻存管，将冻存管放入液氮中于- 80 ℃冰箱保存。

1.7 基因芯片检测 将空白组、模型组和人迎组全部主动脉弓样本各取出100 mg，研磨均匀成粉末状，提取总RNA；使用NanoDrop 1 000核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度，使用变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性；按照以下步骤制备基因芯片表达谱：制备Poly-A RNA质控，合成第一链cDNA和第二链cDNA，再合成cRNA的体外逆转录，对cRNA进行纯化，随后合成第二轮单链cDNA，使用RNaseH水解RNA，纯化第二轮单链cDNA并片段化和标记单链cDNA；按照以下步骤进行芯片杂交：制备杂交反应混合液，添加杂交反应混合液到片段化与禄记后的单链cDNA，进行杂交芯片注入；芯片杂交后进行洗染，洗染结束后，检查芯片表面玻璃有无气泡，灰尘等，仔细擦拭芯片表面，然后使用Affymetrix Gene Chip 7G microarray scanner扫描芯片。

将扫描的CEL格式图像输入到Affymetrix Expression console software，对基因芯片图像进行数据分析，应用Robust Multichip Average 计算方法对基因数据进行归一化处理之后，用荧光共聚焦显微镜扫读结果进行比较分析，得到各组基因的荧光信号强度，由于正确碱基互补双链具有较高的热力学稳定性，因此，探针与样品分子在某位点配对有差异时该位点的荧光强度就会有所不同。将空白组与模型组的基因的荧光信号强度进行比较，将模型组与人迎组的基因的荧光信号强度进行比较，并用Transcriptome Analysis console对比较的比值进行分析，判断基因差异表达的标准及筛选出样本之间的差异表达基因：两个基因比值的fold change≥ 1.5为表达上调，fold change≤-1.5为表达下调，-1.5～1.5之间为不存在显著表达差异。

2 结果

2.1 各组大鼠血压比较 28 d后，模型组大鼠收缩压由（165.5±14）mmHg上 升 至（187.6±1） mmHg，差异有统计学意义（P＜0.01）；与空白组相比，人迎组大鼠收缩压在针刺第1、5、9、13、17、21、25、28天均呈上升趋势（P＜0.01）；与模型组相比，人迎组大鼠收缩压第9天（P＜0.01）和13、17、21、25、28天（P＜0.05） 明显下降（P＜0.05），说明针刺人迎穴对于降低SHR的血压具有较好的短期效应。见图1。

图1 各组大鼠收缩压测量值

2.2 基因芯片筛查结果 模型组和空白组比较： 452个基因表达上调，245个基因表达下调； 针刺干预后人迎组和模型组比较： 261个基因表达上调，986个基因表达下调。经统计，有 102个基因在模型组和人迎组均发生显著性表达差异，其中有86个基因表达在模型组中升高，在人迎组中降低，有16个基因表达在模型组中降低，在人迎组中升高（Fold Change≥ 1.5或≤-1.5，P＜0.05）。

2.3 KEGG信号通路分析 如表1所示：与空白组相比，模型组有12条通路被激活，与模型组相比较，人迎组有10条通路被激活（P＜0.05）。其中细胞外基质受体相互作用通路（ECM-receptor interaction）中，有12个基因在模型组VS空白组、人迎组VS模型组都出现差异性表达，分别为：LAMA2, CD36, LAMC3,LAMA5, COL2A1, ITGA3, LAMC1, LAMB1, SV2C,COL5A2, FN1, SPP1；且在模型组VS空白组皆表达上调，在人迎组VS模型组皆表达下调（Fold Change≥ 1.5或≤-1.5，P＜0.05）。

表1 KEGG信号通路分析显示的被激活通路

3 讨论

本实验显示，针刺人迎穴能明显地降低SHR的血压。人迎穴属足阳明胃经穴，“气海”所出之门户，多条经脉经气相通，有通达气血之功[11]。根据人迎穴定位来分析，组织深部的颈动脉窦及相关神经、血管为降压效应的重要结构。其压力感受器接受刺激后传入中枢，传出作用于相应效应器，而产生降压效果[12-13]。本实验运用基因芯片技术检测出大鼠在针刺干预前后主动脉弓基因表达的差异，提示针刺人迎穴可能通过调控相关基因的表达而产生降压作用。

研究[14]表明，高血压状态下的VSMCs增殖—凋亡平衡失调是高血压血管重构的中心环节之一。本实验模型组VS空白组转录翻译LN与 FN的基因表达均上调，人迎组VS模型组的相同基因的表达均下调，提示针刺人迎穴可能通过调控细胞外基质受体相互作用通路，抑制LAMA2、LAMC3、LAMA5、LAMC1、LAMB1、Fn1等基因的表达，减少LN、 FN的生成，改善主动脉血管重构，从而降低SHR大鼠的收缩压和舒张压。后续实验可对关键基因进行实时定量荧光分析，以进一步验证本实验结果，以及明确针刺人迎穴对于高血压血管重构的相关机制。

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