外泌体参与骨骼肌机能调控研究进展

杨东丽，杨 琼，罗 嘉，谭 娅,4，蒲红州，张顺华*，朱 砺*

(1.四川农业大学动物科技学院，四川成都 611130；2.成都农业科技职业学院，四川成都 6111305；3.四川省南江县农业局，四川南江 635600；4.贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005)

骨骼肌是动物躯体重要的组成部分，也是畜禽生产经济效益的主要部分,占动物体质量的40%左右。骨骼肌的生长发育与动物体健康及产肉动物的生产性能有着密切的联系。肌纤维发育过程首先是中胚层干细胞分化成为成肌细胞(myoblast)，然后成肌细胞融合形成肌管(myotube)，肌管由多个细胞融合形成，因此含有多个核，并且含有肌原纤维，随着胚胎肌肉的发育，肌原纤维在肌管细胞内逐渐增多，最终发育形成肌纤维和肌肉组织。动物骨骼肌肌纤维数目在胚胎发育期间基本上就已固定，出生后，由于肌纤维的肥大，肌肉表现出增大增粗。骨骼肌的生长发育是一个非常复杂的生物学过程，受到多种因素的调控。

外泌体(exosomes)又称外泌小体，是一种双层膜结构的囊性小泡，直径 30 nm～100 nm，源于细胞内吞系统中的晚期内体, 其广泛存在于各种体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液、精液、乳汁、羊水、腹水、阴道/肺泡灌洗液等[1]。外泌体内含丰富的与其来源细胞相关的蛋白质、脂质、mRNA和miRNA等多种生物成分，可以在细胞间进行物质和信息传递[2-3]。近年来的研究表明，外泌体的功能与其来源细胞或者环境的性质相关，可以作为一种信息载体对骨骼肌生长发育及疾病状况起到重要的调节作用。本文就外泌体的发现及作用，外泌体分离与鉴定方法以及外泌体在骨骼肌生长发育及相关疾病中的作用等研究进展进行综述。

1 外泌体的发现及应用

1.1 外泌体的发现

1983年Pan B T等[4]发现羊未成熟红细胞可以分泌囊泡结构，1987年Johnstone R M等[5]将其命名为外泌体(exosomes)。外泌体在蔗糖溶液中的密度为1.10 g/mL～1.20 g/mL，直径为30 nm～100 nm。一直以来它们在很大程度上被认为是细胞碎片的传播者和多余的大分子。直到2007年Valadi H等[2]研究发现,外泌体可作为细胞间基因交流的一种新的机制，可转移功能性RNA分子，包括mRNA和miRNA。这一发现激起了人们对外泌体领域的兴趣。外泌体的产生机制十分复杂，并且受到多种因子的调控作用。目前研究者比较认同的机制是:外泌体由细胞在内吞时形成的多泡体(multivesicular bodies，MVBs)内部产生 ，在胞外分泌的过程中，MVBs包含的腔内囊泡(intralumenal vesicles，ILVs) 可以从MVBs的内腔释放到胞外环境中，这些ILVs就是外泌体[2]。研究表明外泌体存在于各种体液当中，包括血液、尿液、乳汁、胸腔积液、唾液、羊水及腹水等几乎所有体液中，并且外泌体能被多种活细胞分泌，如间充质细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、免疫细胞、血小板、成肌细胞和肿瘤细胞[6-9]。

1.2 外泌体的应用

外泌体含有表面分子，当其到胞外后能够有针对性地到达受体细胞，一旦附着至靶细胞，外泌体可以诱导经由受体配体相互作用的信号，或者可以通过内吞作用和/或吞噬作用与靶细胞膜内化，又或与靶细胞融合将其内容物递送到其细胞质中，由此改变受体细胞的生理状态[10]。大量的研究证实外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原递呈、肿瘤的生长与迁移、心血管疾病、组织损伤的修复等[11-12]。因为不同细胞类型分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，所以其可作为疾病诊断的生物标志物，例如Melo S A等[13]发现细胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1(glypican 1,GPC1)在胰腺癌个体血液中,外泌体含量特别丰富，GPC1能够以100%的准确率和敏感性诊断出早期和晚期胰腺癌；Alegre E等[14]研究也发现外泌体中包含有黑色素瘤标志基因MIA、S100B及肿瘤标志物酪氨酸酶相关蛋白2(Tyrp2)存在，并证实了外泌体中的这些标记物的潜在临床应用价值。另外，Ayuko H等[15]研究表明,不同细胞分泌的外泌体拥有不同的整合素类型，从而靶向不同的器官，影响特定器官转移前微环境的形成，这一结果说明外泌体的脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的物质，可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。

2 外泌体的分离与鉴定

2.1 外泌体的分离

外泌体的分离纯化，常用的方法有差速超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法等，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。随着研究的深入，外泌体的分离方法也越来越多，免疫磁珠法、色谱法、沉淀试剂盒、差速离心结合试剂盒、凝胶排阻分离法、膜亲和试剂盒等多种手段都可以用来分离不同来源外泌体，并通过它们表面标志物和密度特异性进一步富集[16]。在以上诸多分离方法中，梯度密度离心法是公认的可以得到最高纯度的分离方法，但是操作相对复杂，使用并不广泛。然而，就目前的分离方法而言，仍没有一种提取方法能同时保证外泌体的含量、纯度以及生物活性，更为关键的是研究者们很难拿到纯的外泌体组分，而多是以外泌体为主要组分的胞外微囊泡，所以外泌体分离纯化方法和技术亟待改进和完善。

2.2 外泌体的鉴定

提取的外泌体的鉴定方式主要是通过形态学、粒子大小以及标志蛋白等方式实现的。目前可以采用原子力显微镜(AFM)、透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析技术(NTA)等方法检测外泌体的形态大小及分布，外泌体形态通常为茶托型或一侧凹陷的半球形，直径为30 nm～100 nm[17]。另外，当电镜图观测到的样品结构不是典型外泌体样结构时，还需要增加免疫胶体金电镜进行验证[17]。对于外泌体标志蛋白的检测可以采用透射电子显微镜(TEM)、流式细胞术(FMC)、蛋白质印迹法(WB)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、质谱分析(MS)等对外泌体特定蛋白质包括CD9、CD63、 CD81、MHC、Alix、flotillin、TSG101、HSC70等多种外泌体标志蛋白进行鉴定[18]。

3 外泌体与骨骼肌功能调控

在外泌体发现的早期，研究者多把研究重点放在外泌体在肿瘤中发挥的重要作用。很多研究结果证实了多种促进肿瘤侵袭和转移的细胞因子、生长因子、黏附分子和细胞外基质蛋白等以外泌体为载体进入肿瘤细胞微环境，从而在肿瘤细胞转移及血管生成等过程中发挥重要作用。近年来，随着对外泌体研究的深入，已证实外泌体调控的细胞间信息交流过程也广泛参与了肌肉的生理及病理过程，并在肌肉生成、肌肉再生、肌肉萎缩等过程中起到不可忽视的作用。

3.1 外泌体与骨骼肌生成

骨骼肌的生成过程主要包括成肌细胞的增殖分化，然后多个成肌细胞融合成多核的肌管，最后肌管进一步发育成肌纤维和肌肉。成肌细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞，具有自我更新和促进肌纤维再生的能力，是体外研究骨骼肌发育调控机理的理想载体。2010年Guescini M等[19]第一次发现成肌细胞可以分泌外泌体，并且在纯化的外泌体中检测到多种蛋白质及线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的存在，进一步推测外泌体可能作为mtDNA的载体将其运输到相邻或远处的靶细胞，在骨骼肌与其他器官和组织之间的信息交流中发挥作用。Forterre A等[20]对成肌细胞外泌体(MB exosomes)和肌管外泌体(MT exosomes)进行蛋白质组学分析发现，在分化过程中肌肉分泌的外泌体携带不同的蛋白质特异性亚群。肌管外泌体与成肌细胞外泌体相比富含肌肉收缩相关蛋白，其中包括肌营养不良蛋白关联糖蛋白1(dystrophin associated glycoprotein 1，DAG1)、丝蛋白Cγ(filamin C gamma, FLNC)、肌联蛋白(titin，TTN)等。用肌管外泌体孵育成肌细胞发现,其可以抑制成肌细胞增殖促进其分化。为了确定肌管的融合度的增加是否是因为成肌细胞接收了肌管外泌体的内含物，Forterre A等[20]用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)阳性的肌管外泌体与非荧光的成肌细胞一起孵育。24 h后在成肌细胞内检测到GFP绿色荧光，进而证实了肌管外泌体可以向成肌细胞传送其内含物。进一步研究结果显示,肌管外泌体可以下调Cyclin-D1和上调Myogenin进而促进肌纤维的分化。随后Choi J S等[21]的研究发现，骨骼肌细胞在分化过程也可以分泌外泌体，并且证实了其中包含了胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors ，IGFs)、干细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、纤维母细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2，FGF2)和血小板源生长因子AA(platelet-derived growth factor-AA，PDGF-AA)等与肌肉发育相关的肌肉生长因子，可以使脂肪间充质干细胞出现成肌化现象。这些数据表明外泌体可以通过释放其内含物参与肌细胞间通讯。另外，Aswad H等[22]研究发现在外泌体耗尽的血清中成肌细胞分化效率降低，这一结果也表明在肌肉成熟过程中外泌体的重要作用。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们通过结合mRNA进而参与基因转录后表达调控。miRNA在肌肉生长发育过程中有重要的调控作用[23]。大量研究表明,多种细胞类型来源的外泌体内均携带多种mRNA、miRNA，lncRNA，它们在外泌体参与细胞间信息传递的作用机制中起到越来越重要的作用。根据ExoCarta( http://www.exocarta.org/)中的统计[24]，已发现与外泌体相关的miRNA有764种，有许多被外泌体携带的miRNA已被证实在生物体中发挥一定的作用。近年来的研究表明,成肌细胞可以分泌外泌体并且可以携带miRNA在细胞之间进行信息的传递。Forterre A等[20]通过对肌管和成肌细胞外泌体包含的miRNA的分析发现，肌肉外泌体中包含有170多种miRNA，其中包括miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-206等研究证实,可以调控肌肉分化的miRNA。为了证明外泌体可以作为miRNA的载体参与肌细胞间通讯，Forterre A等[20]用在C2C12成肌细胞中不能正常表达的秀丽隐杆线虫miR-238(CaenorhabditiselegansmiR-238，cel-miRNA-238)转染肌管，使其在肌管中表达。用转染后的肌管外泌体孵育后，在成肌细胞中检测到了cel-miRNA-238，这一结果表明,肌肉分泌的外泌体可以作为miRNA的载体对其进行物理转移从而参与肌细胞间通讯。进一步试验结果显示，在成肌细胞分化过程中，肌管外泌体携带的miRNA会使成肌细胞去乙酰化酶1(Sirtuin 1)表达下调，进而影响成肌细胞基因的表达以及其分化。有趣的是同样以成肌细胞为模型进行试验，萎缩的肌管中miR-23a[25]和miR-182[26]胞内表达水平降低，而在其分泌的外泌体中的含量增加。这些试验表明，肌肉分泌的外泌体可以通过运输miRNA进而发挥其调控作用。除了骨骼肌细胞自身分泌外泌体之外，其他细胞类型来源的外泌体在肌肉生成中也发挥作用。间充质干细胞分泌的外泌体在体外可以促进肌肉和血管的的生成[27]；乳清蛋白来源的外泌体可以促进肌管中蛋白的合成及其肥大[28]；脂肪分泌的外泌体也可以显著抑制骨骼肌细胞蛋白激酶B的磷酸化水平[29]。

3.2 外泌体与骨骼肌再生

再生医学的策略之一是细胞疗法，用于改善受损组织的功能和其再生能力。虽然以细胞为基础的治疗在组织修护方面有明显的有益效果，但仍存在一些担忧，如移植细胞生存受限和其再生能力减弱，以及免疫介导的排斥反应。近年来因外泌体病理性和其治疗效果多样性，越来越多的研究表明，外泌体在肌肉损伤中有很大的治疗潜能。每种类型的外泌体都有不同的功能，这取决于其来源细胞的功能。最近的研究表明多种有分泌能力的细胞分泌的外泌体都有促进组织再生的潜力。例如，干细胞和祖细胞分泌的外泌体在各种损伤组织中都有很重要的促进修护和再生的作用，包括肾脏[30]、心肌[31]和肝[32]等。与此同时，外泌体在骨骼肌损伤中的作用也逐渐被揭示出来。

骨骼肌损伤之后，炎性细胞和基质细胞会分泌一些细胞因子和生长因子，这些自分泌/旁分泌因子不仅可以为成肌细胞和卫星细胞的迁移、活化及分化提供有利条件，并且可以平衡肌肉再生和纤维化。研究表明HGF是肌肉干细胞活化及向受损部位转移的强有力的催化剂[33]。肌肉的修护对HGF有剂量的依赖性，并且HGF可以和FGF2、 IGF1、及转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等多种成肌因子协同作用，与单个成肌因子作用相比，可以显著提高骨骼肌的修护和再生[34]。Choi J S等[21]的研究发现，来源于分化期骨骼肌细胞的exosome富含多种成肌因子，其中包括HGF，将其注射到肌肉损伤部位可以显著减少纤维化面积，增加再生肌纤维的数量，进而促进骨骼肌的再生。骨骼肌应对损伤是一个非常复杂的过程，会涉及到细胞微环境和一些有助于肌肉平衡和重塑的因素。Fry C等[35]研究发现肌肉前体细胞(muscle precursor cells，MPC)与肌肉成纤维细胞共培养使胶原蛋白Col1a2、Col3a1、Col6a2以及纤连蛋白(fibronectin)表达显著下调。敲除MPC肌源性miRNA(myo-miRNA)，miR-206，会使调节成纤维细胞胶原蛋白生物合成的核糖体结合蛋白1抗体(Rrbp1)及胶原蛋白表达增加。在体外miR-206在活化的卫星细胞(satellite cells)中高表达。用Pax7/DTA小鼠模型，在卫星细胞耗尽的情况下机械过载处理后miR-206的表达并未上调。这和Rrbp1及Col1a2、Col3a1、Col6a2表达上调相关。进一步研究表明,MPC释放的外泌体包含有miR-206，其通过调节Rrbp1进而调节肌肉成纤维细胞的胶原蛋白的合成，最终调节骨骼肌胞外基质的沉积及肌肉组织重塑。这个发现给人们提供了一个新的见解,即：骨骼肌和MPC可以通过外泌体与其他细胞类型相互作用，并进一步活化调节肌肉组织修护和再生的胞外环境。有研究表明，除了骨骼肌细胞自身分泌外泌体之外，其他细胞类型来源的外泌体在骨骼肌再生中也具有一定作用。Nakamura Y等[27]的研究就证明了来源于间充质干细胞的外泌体在骨骼肌再生中的重要作用。间充质干细胞的外泌体在体外可以促进肌肉和血管的的生成，在体内肌肉受损模型中可以促进骨骼肌的再生。尽管间充质干细胞分泌的外泌体中包含的与肌肉修护相关的细胞因子比较少，但是却鉴别出了与肌肉修护相关microRNA，其中miR-494起到了部分作用。

3.3 外泌体与肌肉萎缩

骨骼肌萎缩是多种疾病的并发症之一，其机制是在病理条件下蛋白质降解增加与蛋白质的合成受阻而使肌肉变得虚弱的现象，骨骼肌萎缩受到多种因素的调控。近年来，人们发现蛋白质降解增加与肌肉环状指基因1(MuRf1)和肌肉萎缩盒F基因(MAFbx,atrogin-1)的表达增加相关。越来越多的研究表明骨骼肌疾病与多种因素有关，随着人们对外泌体各方面研究的深入，其在骨骼肌疾病中发挥的作用逐渐受到重视。

有研究表明肿瘤分泌的微泡可以诱导骨骼肌细胞的凋亡，因为这种微泡携带的miR-21可以通过小鼠成肌细胞的toll样受体7(TLR7)进行信息传递，进而促进细胞的凋亡[36]。叉形头转录因子3(forkhead box O3，FOXO3a)可以提高泛素蛋白酶和自噬溶酶体蛋白水解系统成分的表达，在肌肉萎缩中有重要作用。Hudson M B等[26]研究证实,miR-182可靶向作用于FOXO3a，可使包括atrogin-1在内的多种FOXO3a靶基因表达受阻。并且发现，在糖皮质激素诱导肌管萎缩情况下，肌管分泌的外泌体中miR-182的丰度显著增加。随后Hudson M B等[25]同样以成肌细胞为细胞模型，研究发现肌管萎缩条件下，miR-23a可以以外泌体为载体，运输到胞外，降低其胞内水平，进而使其对靶基因MuRf1和atrogin-1的抑制作用减弱，进而导致肌肉萎缩。这些试验结果证实了在肌肉萎缩的情况下，外泌体对miRNA的装载是一个具有选择性并且高度监管的过程，通过这个机制肌肉细胞可以很快的减少一些特殊的胞内miRNA的水平。miR-29a在组织纤维化中起到不可忽视的作用，研究表明，其在缺血预处理(remote ischemic conditioning，RIC)组织的边缘或者RIC处理之后肌肉分泌的外泌体中高表达，即使是在分化的成肌细胞分泌的外泌体中，缺氧处理也会使得miR-29a的表达显著升高[37]。Hu Z等[38]的研究表明，年龄引起的肌肉衰老是因为在这个过程中miR-29被wnt-3a活化，从而使得p85α, IGF-1 and B-myb等信号蛋白的表达受到抑制，进而祖细胞(MPCs)增殖受阻，从而促进肌肉萎缩。在慢性肾脏病(chronic kidney disease，CDK)中，肌肉萎缩是一个严重的并发症，因为它大大增加发病率和病死率。Hu Z等[38]证实了CDK抑制miR-29在肌肉中的表达，进一步使得转录因子YY-1高表达，最终使肌肉的生成受阻。但miR-29是否能够通过外泌体或者是微泡传递进而对肌肉萎缩产生影响还有待进一步的研究。

4 结语

外泌体的发现为人们提供进一步了解骨骼肌以及骨骼肌与其他器官之间的细胞间通讯的新视角。外泌体以及以外泌体为运输载体的microRNA可以调节肌肉的发展、再生及疾病。然而到目前为止，对外泌体复杂的生物学功能了解有限，准确、高效而标准化的纯化方法对于外泌体的后续研究至关重要。人们期待着有关外泌体的生物学研究能够提供更丰富、更准确的信息, 为进一步充分了解外泌体调节肌肉发育机制提供重要的理论导向，并应用于实际生产中去。

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