MicroRNA的生物学功能及其与肿瘤诊断和治疗的研究进展

王明阳，王光磊，陈新亮，张 燚，龙 淼

(沈阳农业大学 畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

1993年Lee在研究线虫的发育时发现了第1个调控发育的基因lin-4，随后又在线虫发育过程中发现microRNA(miRNA)分子let-7，从此打开了人们对于miRNA的研究大门[1]。在之后的研究中人们认识到miRNA是一种高度保守的小分子。miRNA在生物体内不参与蛋白质的合成，但是在编码蛋白的基因表达方面有着非常重要的调控作用。miRNA在细胞核中在DNA聚合酶2作用下由编码的miRNA基因转录成miRNA的前体pre-miRNA，再由细胞核内的RNase3-Drosha酶经加工剪切为70个核苷酸，类似发夹结构的pre-miRNA。pre-miRNA在核转运蛋白Exportin5的作用下，从细胞核内运输到细胞质中，在细胞质中在RNase3-Dicer酶的作用下，pre-miRNA被剪成双链的miRNA，成熟的miRNA与其互补的序列结合成双螺旋结构，随后双螺旋解旋，其中一条与RNA诱导沉默复合物RISC结合，识别靶mRNA并阻止其翻译[2]。

1 miRNA的生物学功能

miRNA作为一种特殊的遗传物质，成为当今学术界研究的热点。对miRNA的研究正在不断增加，原因是科学家认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫、果蝇、小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNA中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性，提示miRNA有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。

1.1 哺乳动物中的miRNA通过对蛋白质编码基因来影响mRNA对蛋白质的翻译

用核糖体分析来测量miRNA对蛋白质产生的总体影响，并将其与同时测量的mRNA水平的影响进行比较。 对于异位和内源性miRNA调节相互作用，蛋白质生产减少的84%是由于mRNA的降低引起的[3]。 表明mRNA水平的变化反映了miRNA对基因表达的影响，并表明目标mRNA的不稳定性是蛋白质含量降低的主要原因。这反映了哺乳动物miRNA主要用于降低靶mRNA水平，使miRNA对蛋白的翻译产生了影响。

1.2 miRNA对肌肉发育的调节作用

Wang Y H等[4]对山羊骨骼肌的两个发育阶段(胎儿阶段和6月龄阶段)miRNA的表达谱进行了综合研究，从胎山羊文库(FC)和6月龄山羊文库(SMC)分别获得了15 627 457和15 593 721个miRNA，鉴定了464种已知miRNA和83种新型miRNA候选物，通过比较miRNA谱，鉴定出336个差异表达的miRNA，然后预测差异表达的miRNA的潜在靶标。为了了解肌肉发育过程中miRNA的调控网络，对两个发育阶段的mRNA表达谱进行了分析，确定了7 322个差异表达基因(DEGs)。然后将miRNA的潜在靶标与DEGs进行比较，筛选出2个基因组的交叉点，称为差异表达靶标(DE-靶标)，其涉及231个途径。具有最小P值的231个途径中的10个显示为网络通路。基于通路和网络的分析，研究发现miR-424-5p和miR-29a可能对肌肉发育具有重要的调控作用，需要进一步研究。这项研究阐明miRNA和mRNA之间的复杂调控网络以及miRNA对肌肉发育的作用。

2 miRNA靶基因的确定

尽管数百种miRNA在最近几年中被发现，但是只有非常少量的miRNA被确定其作用，许多其他miRNA的作用还没有被阐明。因此,发现miRNA的作用靶点成为了解其在不同的生理过程中的功能的关键。

2.1 基因芯片法

将miRNA成熟体双链或腺病毒载体转染至细胞中，使得miRNA在细胞中表达提高，之后利用基因芯片分析mRNA的变化，以找出相应miRNA的靶基因。由于miRNA在体内通过翻译抑制或影响mRNA的稳定性起作用，因此这种方法在寻找翻译抑制作用的miRNA的靶基因时存在一定困难。

2.2免疫共沉淀法

利用AGO蛋白家族既能结合miRNA又能结合mRNA的特性，分别使用AGO-1和AGO-2蛋白的单克隆抗体在人类细胞中进行免疫共沉淀，得到与AGO-1和AGO-2蛋白结合的mRNA条带，并通过克隆测序对这些mRNA进行鉴定。同时从与AGO-1蛋白结合的mRNA中随机挑选几条进行荧光素酶报告基因检测,鉴定哪条是miRNA的靶基因[5]。

2.3 细胞培养稳定同位素标记技术

细胞培养稳定同位素标记技术(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)是指在细胞培养过程中利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术，对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。它不仅可以对蛋白质进行定性分析，还可以通过质谱图上轻重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平，实现对蛋白的精确定量[6]。

2.4 miRNA靶基因的鉴定

目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法[7]。其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3′UTR构建到荧光素酶基因的3′UTR中，之后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3′UTR中是否含有miRNA的靶位点。该方法因为是对荧光信号进行检测，因而检测的准确率较高。

3 miRNA在肿瘤方面的应用

miRNA在生物的生命过程和疾病发生过程中扮演着十分重要的角色[8]。其中尤其与肿瘤的发生和发展关系十分密切。在肿瘤的发生和发展中miRNA常作为肿瘤临床诊断的标志物[9]。而越来越多的研究表明，miRNA作为原癌基因和抑癌基因也为临床癌症的诊疗提供了一个新思路。

3.1 miRNA在肿瘤诊断方面的应用

传统的恶性肿瘤确诊方法是通过外科手术方法在肿瘤处取样做石蜡切片，这种诊断方式十分繁琐。目前有研究表明，癌症患者体内miRNA表达差异显著。miRNA有希望成为癌症治疗中的新靶标和工具。有报道指出，在胃癌细胞系MKN-45的SP细胞内有关键miRNA，包括hsa-miR-3175、hsa-miR-203、hsa-miR-130a、hsa-miR-324-5p、hsa-miR -34a和hsa-miR-25-star。这些关键的miRNA可通过进一步研究作为胃癌诊断的标志物[10]。研究认为，通过分析黑色素瘤患者的血清的754个miRNA,结果表明miR-146a在UM患者血清以及血清外显子中均有上调。在福尔马林固定的石蜡包埋的UM中也检测到miR-21和miR-146a的上调，因此miR-146a可以被认为是UM的潜在循环标志物[11]。通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)在29例良性前列腺增生(BPH)患者和215例前列腺癌患者的无细胞尿液样品中92种miRNA的表达水平的分析，发现了2组新的miRNA生物标志物。这些发现是否可以准确预测前列腺癌的存在和前列腺切除术后复发的可能性，需要进一步的临床试验。但这一发现为前列腺癌的临床诊断提供了新思路[12]。逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测了40个对照受试者，187个早期乳腺癌患者和45个转移性乳腺癌患者的miRNA水平，发现miR-1280，miR-1260和miR-720在乳腺癌患者血液中上调，miR-1280水平在乳腺癌患者中显著增加。在37例转移性乳腺癌患者中，miR-1280水平显著降低。所以,miR-1280不是原始的miRNA，而是tRNA Leu衍生的片段。表明循环的tRNA衍生的miRNA，miR-1280在乳腺癌患者中的不同表达，可能作为ER阳性乳腺癌的生物标志物[13]。这也为乳腺癌的诊断提供了新思路。

3.2 miRNA在肿瘤治疗方面的应用

当代医学对肿瘤的治疗通常采用外科手术切除癌变的组织或器官，之后采取放疗、化疗的方法杀死癌细胞防止扩散。外科手术可以清除病变的组织和器官，但无法完全清除体内的癌细胞，所以需要后续的放疗和化疗。但放疗和化疗不仅杀死癌细胞，也破坏了健康的组织和器官，所以寻找一种安全有效的可代替放疗、化疗的方法变得十分重要。研究发现，miR-503在晚期前列腺癌组织和细胞系中显著下调，miR-503的下调与侵袭性临床病理特征和前列腺癌患者预后不良密切相关。表明miR-503在前列腺癌治疗中的潜在应用[14]。miR-134-3p的表达在人卵巢癌干细胞(OCSCs)和CD44- / CD133-卵巢癌中显著变化。miR-134-3p在人类OCSCs中的过表达不仅可以抑制RAB27A的表达，而且可以有效地下调一些肿瘤增殖和侵袭基因的表达。 miR-134-3p的过度表达不仅可以抑制人类OCSCs的体外增殖和细胞周期进程，而且可以降低裸鼠的致瘤性[15]。在肝癌患者血清和肝癌细胞系中观察到miR-200a的表达水平降低，miR-200a在肝癌细胞系中的过表达降低了细胞增殖、迁移和侵袭。转录因子Foxa被鉴定为miR-200a的新靶标，并在miR-200a过表达的细胞中mRNA和蛋白质水平下调。同时，Foxa2的恢复显著抑制了miR-200a的肿瘤抑制作用。这表明miR-200a通过靶向Foxa2调节肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，表明miR-200a可能作为肝癌诊断和治疗的潜在分子[16]。 miR-520e通过直接靶向Zbtb7a的3'非翻译区(UTR)并因此降低Zbtb7a蛋白水平，显著调节NSCLC细胞生长，细胞侵袭和细胞迁移。 miR-520e对非小细胞肺癌进展的这些影响可以通过Zbtb7a在A549细胞中的过表达来说明。 此外，miR-520e水平和Zbtb7a水平均与非小细胞肺癌细胞中的Wnt信号传导相关。 这些结果表明，过表达的miR-520e调节非小细胞肺癌细胞生长、侵袭和迁移是通过靶向调节Zbtb7a在Wnt信号通路的传导来产生作用的，说明miRNA-520e通过靶向Zbtb7a介导的Wnt信号通路抑制非小细胞肺癌细胞生长[17]。采用RT-qPCR技术检测70例HCC和相应肿瘤相邻组织中miR-577的相对表达，用卡方检验分析miR-577表达及临床特征。将miR-577质粒转染HepG2细胞;通过流式细胞术检测细胞周期，通过MTT法和BrdU法检测细胞增殖，流式细胞术和caspase3/7活性分析检测细胞凋亡。通过免疫组织化学测定β-catenin的表达。 Spearman相关分析用于分析miR-577和β-catenin之间的关系。RT-qPCR和Western blot检测转染HepG2细胞中β-catenin的表达。结果发现与正常肿瘤相邻组织相比，肝癌组织中miR-577的相对表达显著降低。 miR-577的低表达与肿瘤大小和晚期肿瘤淋巴结转移阶段显著相关。 miR-577质粒的转染可抑制细胞增殖，增强细胞凋亡，阻断G0/G1期细胞周期。 HCC组miR-577与β-catenin的下游靶标表达呈显著负相关。转染后HepG2细胞mRNA和蛋白表达下调。说明miR-577的低表达与HCC组织恶性临床病理特征有关，miR-577可通过下调β-catenin抑制HCC的生长[18]。研究发现miR-146a与相应的正常组织相比，在宫颈癌(CaCx)中表现出高表达，但结直肠癌(CRC)表达相对较低。然而，miR-146a的异位表达抑制宫颈癌(CaCx)和结直肠癌(CRC)细胞的增殖，并抑制其迁移和侵袭。当内源性miR-146a的表达被抑制时，宫颈癌(CaCx)和结直肠癌(CRC)细胞的增殖，迁移和侵袭能力增加，表明miR-146a具有抗肿瘤发生功能。 miR-146a的重新表达下调关键信号转导中间体的表达，即CTNNB1、STAT3、RELA、CCND1和SNAI1，增强TP53和CDH1表达。这说明miR-146a为人宫颈癌和大肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制提供了依据[19]。这些都表明miRNA可能成为癌症治疗的新方法。

3.3 miRNA在肿瘤预后方面的应用

肿瘤的预后是当今医学的一大难题，但是大量研究表明癌症的发生与体内miRNA的表达水平有着十分密切的关系。研究发现miR-148靶向的39个非翻译区中的单核苷酸多态性(SNPs)可以改变其结合强度，影响癌症的易感性和预后[20]。miR-22和TIAM1可能在结直肠癌的发生和发展中发挥调节作用，低miR-22水平与结直肠癌患者预后不良有关[21]。miR-330-5p可用于食管癌腺癌新辅助放化疗敏感性的调节[22]，miR-33a抑制上皮-间质转化和转移，可能是非小细胞肺癌的预后指标[23]，表明miRNA可作为癌症预后的生物学标志。

4 结语

研究发现的大量miRNA在细胞的早期发育、分化、更新、基因的调节和表达、以及肿瘤的发生和转移都有十分密切的关系，但许多miRNA与靶基因的作用机理，以及miRNA对下游靶基因的识别和鉴定都没有详细的阐述。而miRNA在病理中的作用，尤其是miRNA在肿瘤的发生、发展中的详细的机理没有明确的阐述，这些将成为今后研究的重点。相信随着对于miRNA研究的深入，miRNA将会越来越多的应用于基因的调控与表达，病理机理的阐述，药物作用的分析，人们对于miRNA的应用也会越来越广泛。

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