电刺激对胰岛素抵抗的C2C12肌管糖转运能力的影响

贾章志 徐晓阳 赵秀峰

摘 要：目的 刺激胰岛素抵抗状态的C2C12肌管产生收缩，观察收缩对其糖代谢的影响。方法 将胰岛素抵抗状态的C2C12肌管分为C组、E组、P组、P+E组。C组和E组用2%BSA无酚红高糖DMEM孵育，P组和P+E组用浓度0.5 mmol/LPA培养液孵育16h。以15V，30ms，2Hz的强度电刺激E组和P+E组60min，测定细胞培养液葡萄糖剩余量、总蛋白量、GLUT4细胞膜蛋白量、AMPK-α2mRNA表达量。结果 （1）P组培养液葡萄糖剩余量明显高于C组，E组培养液葡萄糖剩余量明显低于C组，P+E组培养液葡萄糖剩余量略高于C组，与P组相比明显下降。各组细胞培养液LDH活性均无显著性差异。（2）与C组相比，P组AMPK-α2基因表达显著下降，E组明显升高，60min电刺激后，P+E组AMPK-α2基因表达较P组明显提高。（3）P组肌管细胞膜GLUT4蛋白量、总蛋白量比C组减少。E组肌管细胞膜GLUT4蛋白量上升，总蛋白量变化不明显。与P组相比，P+E组肌管细胞膜GLUT4蛋白量升高，总蛋白无显著变化。结论 15V，30ms，2Hz电刺激棕榈酸诱导的胰岛素抵抗C2C12肌管60min可以改善胰岛素抵抗的状态。

关键词：C2C12 棕榈酸 胰岛素抵抗 电刺激 AMPK-α2 GLUT4

中图分类号：G80-32 文献标识码：A 文章编号：2095-2813（2018）06（b）-0018-02

电刺激是采用特定频率、波形和强度的脉冲电流来刺激骨骼肌收缩产生运动，主要用于疲劳的恢复、运动损伤的治疗、增加肌肉力量等方面。国外研究发现电刺激肌管能迅速改变骨骼肌细胞的基因表达，这些特征都与活体肌肉收缩变化类似。本研究利用电刺激体外培养的肌管收缩，探究收缩对胰岛素抵抗肌管的作用。

1 研究材料与方法

1.1 研究材料

小鼠骨骼肌肌母细胞株（C2C12细胞）购买于由南方医科大学。

1.2 实验方案

利用本实验室前期建立的PA诱导的C2C12胰岛素抵抗模型，做电刺激对胰岛素抵抗机制的研究，将肌管饥饿处理12h后分为C组、E组、P组、P+E组。C组和E组用2%BSA无酚红高糖DMEM孵育，P组和P+E组用浓度0.5mmol/LPA培养液孵育16h，换电刺激液（4mL），以15V，30ms，2Hz的强度电刺激E组和P+E组60min，各组同时收样，比色法比较C2C12肌管培养液乳酸脱氢酶（LDH）活性，葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测C2C12肌管培养液葡萄糖剩余量，western blot方法测定GLUT4表达，RT-PCR测试肌管中AMPK-α2mRNA的表达。

1.3 数据统计处理

利用SPSS 19.0软件进行数据处理，用平均值±标准差的方式表示数据。各组数据间差异的显著性用单因素方差分析检验，P<0.05即具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。

2 研究结果

2.1 不同干预后C2C12肌管培养液糖剩余量、LDH活性的变化

电刺激60min后，E组肌管培养液中葡萄糖剩余量明显低于C组（P<0.05），P组培养液中的葡萄糖剩余量明显高于C组（P<0.05），P+E组培养液的葡萄糖剩余量明显低于P组（P<0.05）。E组、P组、P+E组培养液中LDH活性与C组相比略有升高，但无显著性差异（P>0.05）。

2.2 不同干预后C2C12肌管AMPK-α2 mRNA含量的变化

P组与C组相比AMPK-α2基因表达显著下降（P<0.05），E组比C组显著升高（P<0.05）。电刺激后，P+E组AMPK-α2基因表达相对P组明显上升（P<0.05）。

2.3 不同干预后C2C12肌管GLUT4蛋白表达

P组肌管细胞膜GLUT4蛋白量比C组低29.14%（P<0.01），总蛋白低25.42%（P<0.01）。E组细胞膜GLUT4蛋白量比C组高6.5%（P<0.05），总蛋白量比C组高3.3%，变化不明显（P>0.05）。与P组相比，P+E组肌管细胞膜GLUT4蛋白量高22.62%（P<0.01），总蛋白量无明显变化（P>0.05）。

3 分析与讨论

3.1 电刺激强度的确定

本研究使用强度为15V，30ms，2Hz电刺激后，各组LDH活性值各组间无显著性差异（P>0.05），E组培养液中葡萄糖剩余量明显低于C组（P<0.05），P+E组培养液中葡萄糖剩余量明显低于P组（P<0.05）。说明本研究所选用的电刺激强度并没有造成肌管的大量损伤和死亡，同时促进了肌管对于葡萄糖的吸收和代谢。

3.2 电刺激对PA诱导的胰岛素抵抗C2C12肌管糖代谢的影响

研究发现处于胰岛素抵抗状态下的大鼠骨骼肌细胞GLUT4mRNA和蛋白表达都具有缺陷[1]，影响大鼠对糖的摄取和利用，运动可以改善大鼠的胰岛素抵抗。对分化5天的C2C12肌管进行电刺激60min后，培养液中的葡萄糖剩余量与C组相比显著下降（P<0.05），电刺激引起的收缩可以有效地促进肌管对糖的吸收和利用。PA孵育后，肌管培养液中葡萄糖的剩余量高于C组（P<0.05），这说明PA损害了肌管糖吸收和代谢功能。而P+E组肌管的葡萄糖剩余量明显低于P组（P<0.05），说明电刺激引起的收缩可以改善由PA带来的胰岛素抵抗。

3.3 电刺激对PA诱导的胰岛素抵抗C2C12肌管AMPK-α2 mRNA表达的影响

60min的电刺激可以引起AMPK-α2表达的上升（P<0.05），与本实验室前期的研究结论一致。P组相对于C组，AMPK-α2表达明显下降（P<0.05）。与P组相比，P+E组AMPK-α2表达得到改善（P<0.05）。在PA诱导产生的胰岛素抵抗状态下，AMPK-α2的表达受到严重损害，而适当的电刺激则可以改善由于胰岛素抵抗造成的AMPK-α2表达下降的结果。我们推测收缩可以通过激活AMPK-α2基因的表达，提高GLUT4的转位和表达，促进骨骼肌對葡萄糖的吸收和利用。

3.4 电刺激对PA诱导的胰岛素抵抗C2C12肌管GLUT4蛋白表达和转位的影响

当机体处于胰岛素抵抗或2型糖尿病状态时，骨骼肌中GLUT4mRNA和GLUT4蛋白表达明显低于正常大鼠[1]。通过电刺激肌管，发现AMPK-α2基因表达上升，同时GLUT4蛋白转位明显增加（P<0.05），总蛋白量也有所上升，与本实验室的前期研究和大多数学者的研究是吻合的。我们可以推测，适宜的电刺激可以通过激活AMPK-α2基因的表达，促进GLUT4的转位和表达，改善细胞摄取葡萄糖的能力。与C组相比，P组GLUT4膜蛋白量和总蛋白量都明显下降（P<0.01），这说明在PA诱导的胰岛素抵抗状态下，C2C12肌管GLUT4蛋白转位和表达明显下降，严重影响了肌管糖摄取的能力。P+E组与P组相比，GLUT4的膜蛋白量明显上升（P<0.01），总蛋白量有所上升（P>0.05）。这说明处于胰岛素抵抗状态的肌管经电刺激引起其收缩后，AMPK-α2基因表达上升，GLUT4的转位和表达得到改善，电刺激引起的收缩可以通过激活AMPK-α2基因的表达，促进GLUT4的转位和表达，改善由PA孵育诱导的胰岛素抵抗状态。

4 结语

15V，30ms，2Hz电刺激棕榈酸诱导的胰岛素抵抗C2C12肌管60min可以改善胰岛素抵抗的状态。

参考文献

[1] 林强.电刺激促进2型糖尿病大鼠骨骼肌细胞葡萄糖运载体4转位的细胞内机制研究[D].复旦大学，2008.