益生菌微囊化技术研究进展

孙玉章，崔　栩，马丰英，王宏华，蒋贻海

(国家动物用保健品工程技术研究中心/青岛蔚蓝生物股份有限公司，山东青岛 266001)

益生菌是一类定植于宿主肠道或生殖系统内，能通过改善宿主机体微生态平衡而产生确切有益功效的活性微生物的总称[1]。目前发现的益生菌共有18个属274个种，主要分为三大类，即乳酸菌类(如嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、屎肠球菌等)、芽胞杆菌类(如枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等)和酵母菌类(如酿酒酵母等)。通过在饲料中添加适当水平的益生菌制剂，能够起到调节畜禽肠道菌群平衡、抑制肠道致病菌定殖、提高动物机体免疫力、改善机体营养状况和提高畜禽的生产性能及抗病性等功能。

活菌数是评价益生菌产品质量的一个重要指标，一般认为摄入的益生菌数量至少应在106CFU/g～107CFU/g才能在宿主机体肠道中定殖并发挥其益生功能[2]。因此，如何提高活菌进入肠道的存活率，为益生菌提供有效的物理屏障保护以抵御宿主机体内高胃酸和胆盐等不利环境是十分必要的。益生菌的微囊化己被证明是提高益生菌在加工和贮存期间存活率和稳定性最好的方法之一。本文仅就益生菌的微囊化技术的研究及应用进展进行综述。

1　微囊化技术

微囊化技术是指利用天然或合成的高分子材料作为壁材，将固体、液体或气体等芯材包埋在生物相容性或可生物降解的聚合物基质或壳体内的一类技术[3]。作为可生物降解的微球微粒递送系统的重要组成部分，微囊化技术可包裹芯材并形成直径在1 μm～250 μm范围内的具有半透性或密封囊膜的微型颗粒，具有提高芯材稳定性，减少不利或毒性作用等功能。

目前，微囊化技术已广泛应用于医药化工、食品加工及农业生物技术等领域。在医药化工领域，微囊化技术可将多种水溶性物质如蛋白、酶、维生素、纳米微粒及各种药物自发包埋在微囊内，并使包埋的物质能够以可控的速率释放[4]。在食品加工领域，微囊化技术可显著提高益生菌在加工过程中的存活数量，从而增强了酸乳及酸乳制品、果汁和风味面包等的保健功能[5-7]；在农业生物技术领域，微囊化技术可用于生产兽用口服疫苗，刺激动物机体产生黏膜免疫应答[8]。

在动物保健品行业中，益生菌的微囊化技术方兴未艾。应用该技术不仅可以提高益生菌本身的抗逆性，增强益生菌制剂对高温、高压或酸碱性等不良环境的抵抗能力，而且提高了益生菌制剂在后续加工、储存和运输过程中的存活率和稳定性等[9]。

2　微囊的壁材选择及包埋工艺

一般而言，益生菌微囊化技术所选择的壁材材料应与微生物细胞及其代谢产物具有良好的生物相容性或可比较容易的被生物降解。目前可供选择的壁材材料按来源可分为天然高分子材料、半合成高分子材料和合成高分子材料等，其中明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、壳聚糖、蛋白类和淀粉等天然高分子材料由于其性能稳定、无毒、生物降解性和生物相容性好、成膜性或成球性优良等特点，是益生菌微囊化技术中最常用的壁材。作为目前应用最为普遍的微囊化壁材材料，海藻酸钠是一种存在于褐藻细胞壁中的天然多糖，生物相容性高，易与阳离子形成凝胶，并且形成的离子型胶体具有在低pH环境下稳定、在中性或微碱性环境中又能溶解的特性。由于海藻酸钠胶体在高亲和力离子或高浓度的非离子凝胶诱导剂存在的情况下会导致凝胶稳定性下降，因此依据包裹芯材的生物特性的不同，常联合应用海藻酸钠与壳聚糖、微孔淀粉、明胶或乳清蛋白等多种传统天然高分子壁材材料的单一或多重复配。

目前，益生菌微囊化方法中应用比较广泛的是挤压法和乳化法。挤压法是先将益生菌与亲水性胶体均匀混合形成细胞悬液，然后通过膜孔将细胞悬液压入固定液中，从而使壁材析出硬化形成直径约2 mm～5 mm的囊粒。挤压法制备过程温和，操作简单、成本低廉，但囊径较大，有可能会降低益生菌细胞的存活率和代谢率，而且规模化工业生产难度较大。乳化法制备海藻酸钠微囊可分为外源乳化法和内源乳化法。外源乳化法是指海藻酸钠溶液与油相混合形成乳化液，通过加入CaCl2溶液，从海藻酸钠外部引发凝胶化反应，该方法在完全固化前会出现凝胶相互相聚集现象，导致微囊形态和流动性差，粒径分布广[10]。内源乳化法是指将海藻酸钠溶液和不溶性钙盐颗粒(如CaCO3等)分散到油相中形成油包水(W/O)型乳状液，再加入冰醋酸使海藻酸钠溶液的pH降低，从而引发不溶性钙盐中Ca2+的释放，自液滴内部形成凝胶微球。研究证明，内源乳化法制备的嗜酸乳杆菌微囊的菌体包封率更高，粒径分布范围更窄，微囊表面更光滑，呈球性更佳。内源乳化法采用难溶性钙盐作为钙源，克服了外源乳化法中CaCl2溶液加入引起的微囊成簇凝聚现象，更易控制微囊粒径，且粒径比较均一，比较可能发展为规模化工业生产技术。内源乳化法在包埋蛋白、酶、多肽类药物的控制释放和微生物细胞的固化方面极具优势。

3　益生菌微囊化技术的应用

3.1　微囊化技术提高益生菌抗逆性的研究

益生菌微囊化技术要解决的核心问题是提高益生菌的抗逆性。如何确保一定数量的活菌能够进入宿主肠道，并且能够抵御宿主机体内高胃酸和胆盐等不利环境，对于益生菌发挥健康功效是十分必要的。国内外已有众多学者在利用微囊化技术提高益生菌的抗逆性方面做了大量研究工作[11]。

杨凯舟等[12]利用海藻酸钠、乳清蛋白和维生素E(分别为20 g/kg、30 g/kg和100 g/kg)为壁材制备的长双歧杆菌微囊在酸奶中保存21 d仍能保持106CFU/g以上的活菌数，耐胃酸试验2.0 h时活菌数仍高达3.16×107CFU/g，较好地解决了长双歧杆菌不耐酸、不耐氧的缺点。张琳等[13]利用乳化凝胶法制备的布拉迪酵母菌和粪肠球菌微囊显著提高了益生菌对储存、高温、胃液和肠液等体内和体外不良环境的抗性，同时肠内缓释试验证实，50 min时布拉迪酵母菌和粪肠球菌微囊的释放率分别可达71.74%和87.47%。Zhou H B等[14]以海藻酸钠为初层包埋材料，分别以海藻糖、壳聚糖为二层、三层包埋材料获得的嗜热乳酸链球菌微囊化制品在冷冻干燥后的活菌计数为8.34lg CFU/g±0.30lg CFU/g，在模拟胃液中处理2.0 h后的存活数为6.45lg CFU/g±0.09lg CFU/g，长期储存稳定性实验证明其多层包埋处理的益生菌微囊化制品具有极佳的稳定性和耐酸性。

3.2　益生菌微囊化技术应用于动物保健品的研究

微囊化技术显著提升了益生菌的抗逆性，为益生菌制剂在动物保健品等工业领域的应用奠定了良好的基础。Rishi P等[15]研究发现，利用微囊化的植物乳杆菌益生元复合制剂饲喂酒精性肝病的大鼠模型，能够显著调节大鼠体内的酒精、内毒素和转氨酶水平，并在一定程度上修复受损的肝组织结构。张慧等[16]证实，在饲粮中添加0.5 kg/1 000 kg的益生菌微囊化制品能显著提高育肥猪的平均日增重、降低料重比并显著降低肠道内的大肠埃希菌含量，对育肥猪的生长有促进作用。魏衎等[17]利用微囊化的鸡源乳酸乳球菌全程饲喂肉仔鸡，42日龄时的肉仔鸡与对照组相比，平均日增重提高了16.94%，料重比降低了16.13%，胸腺相对重量提高了46.56%，法氏囊相对重量提高了16.67%，极大提升了肉仔鸡的生长性能。胡锐等[18]采用喷雾干燥工艺制备的中药复合益生元微囊制剂能够极显著提高斜带石斑鱼机体的免疫活性细胞吞噬率、超氧化物歧化酶活性和溶菌酶活性，显著提高了斜带石斑鱼的存活率和抗病性。

当前饲用抗生素仍然是我国畜禽养殖业中用于抑制病原微生物增殖和促进畜禽生长的主要饲料添加剂之一，随着我国养殖业规模化、产业化程度的提高，以及畜禽肉制品国际化、标准化的要求，限制甚至禁止抗生素的使用是将来集约化畜禽养殖业发展的必然趋势。益生菌作为一种微生态制剂和潜在的抗生素替代品，具有调节肠道菌群平衡，预防病原微生物感染和提高饲料利用率等优点，并且不存在抗生素耐药性和药物残留的问题，因此益生菌制剂在动物保健品等领域的应用越来越受到重视。虽然目前受限于益生菌特性和制剂工艺流程，益生菌制剂应用于规模化畜禽养殖场的实例还不多[19-20]，而微囊化技术正是推动益生菌制剂作为抗生素替代品和动物保健品广泛应用于畜禽养殖业的重要助推器之一。

3.3 益生菌微囊化技术应用于黏膜免疫疫苗的研究

黏膜免疫系统是指机体与外界相通的腔道黏膜表面的免疫系统，主要由消化道、呼吸道、泌尿生殖道黏膜及某些外分泌腺(如唾液腺、泪腺及乳腺等)黏膜相关的淋巴组织组成[21]。研究证实，哺乳动物的胃肠道黏膜上皮及固有层内含有大量免疫细胞及免疫分子，能够通过分泌型IgA和IgM阻止病原微生物在黏膜上皮层的黏附和定殖。益生菌是诱导黏膜免疫极好的免疫佐剂和疫苗载体。

Eratte D等[22]研究证实，微囊化技术可以显著提高干酪乳杆菌黏附在肠壁绒毛上的存活能力，因此可以作为不影响其功能特性的肠道黏膜微粒递送系统。Poorbaghi S L等[23]研究证实，利用微囊化的嗜酸乳杆菌作为免疫佐剂，能够有效地调节H9N2亚型禽流感灭活疫苗刺激体液免疫产生的抗体滴度，而且与攻毒后对照组相比，嗜酸乳杆菌微囊组极显著地降低了鸡体肠道内的病毒载量。Jiang T等[24]以海藻酸钠和壳聚糖为壁材多层包埋表达M细胞归巢肽与BmpB抗原肽融合蛋白的重组植物乳杆菌，在模拟胃液和模拟小肠液试验中的2.0 h存活率高达65%，首次通过口服免疫小鼠4周后，在血清和粪便样品中分别检测到了特异性IgG和IgA的高水平表达，表明益生菌的微囊化技术有助于研究和开发新型黏膜免疫的疫苗载体和递送系统。

4　展望

微囊化技术作为21世纪重点研究和开发的高新技术之一，已经在医药化工、食品加工和农业生物技术等多个领域取得了重要进展。但就益生菌的微囊化技术而言，目前国内的研究主要还是局限于益生菌用于食品加工和饲料添加剂的微囊化包埋工艺条件的优化上，对于包埋后益生菌与微囊壁材的相互作用机理等上游基础研究和规模化工厂生产等下游应用推广的实例均较匮乏。

随着现代免疫学、分子生物学和疫苗学的发展，黏膜免疫和口服疫苗得到了越来越多学者的关注。然而，由于缺少能够有效递送抗原到达黏膜免疫诱导位点的载体，多年来口服疫苗的发展一直很缓慢。作为被动黏膜免疫递送系统的重要组成部分，基于革兰阳性菌增强基质(Gram-positive bacterial enhancer matrix，GEM)建立的新型益生菌表面展示系统,已经在动物体内外试验中展示出良好的应用潜力[25]，不仅可以作为天然的免疫佐剂激活机体的先天性免疫，还能刺激免疫细胞产生特异性抗体和Th1/Th2型平衡的免疫应答。微囊化技术的发展为黏膜免疫口服疫苗的研究和开发开辟了新的途径，利用生物可降解的高分子壁材包埋GEM颗粒，理论上可以持续传递抗原至消化道黏膜、包被抗原不受胃酸和消化酶的影响，而且可以作为新型黏膜免疫佐剂和递送抗原载体，其应用前景广阔。