猪伪狂犬病流行状况和疫苗应用的研究进展

张姗姗,冷　雪,时　坤,李健明,宫庆龙,刘　艺,孙志博,刘亚东,杜　锐

(吉林农业大学，吉林长春 130118)

猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以仔猪神经系统紊乱和高死亡率、育肥猪呼吸障碍和生长缓慢以及母猪繁殖障碍等为主要特征的病毒性传染病。PRV有广泛的宿主范围，可感染多种哺乳动物，猪是PRV的天然宿主和重要的传染源[1]。PRV基因组是双链线性DNA，约143 kb，含有70个开放阅读框，具有很强的遗传稳定性[2]。GC含量高达70%以上，是疱疹病毒中GC含量最高的。其基因组包括独特的长区段(UL)、短区段(US)及两侧的末端重复序列(TR)和内部重复序列(IR)。病毒基因组至少包括70个基因，可以编码70种～100种病毒蛋白，其中多数基因是病毒复制非必需的。病毒增殖必需的糖蛋白主要有gL、gD、gB、gK、gH；非必需糖蛋白主要包括gG、gE、gC、gI、gM和gN等[3]。PRV毒力受多个基因编码蛋白的影响，如gE、gC、gI、gD、gB、gH、TK、PK及RR等，删除或者缺失这些基因可以显著降低PRV毒力。

1　猪伪狂犬病的流行情况

1813年伪狂犬病最早发现于美国，1902年匈牙利学者Aujeszky首次报道该病病原是一种不同于狂犬病病毒的新病毒；该病毒1931年由美国科学家Shope从牛体内分离，1934年Sabin等证实该病病原属于疱疹病毒。随后该病在很多养猪国家均有发生，主要出现于南美洲、亚洲和欧洲等猪群密集地区，仅在挪威、芬兰和马耳他地区没有伪狂犬病病毒感染的报道，而在奥地利、瑞典、丹麦、英国、加拿大和新西兰以及美国等地区PRV已经根除[4-5]。

中国于20世纪50年代首次报道猪伪狂犬病的暴发，自20世纪80年代以来，从匈牙利引进的Bartha-K61疫苗广泛应用于中国，该疫苗具有较好的免疫原性，相对有效的控制了猪伪狂犬病发生[6]。然而，近几年来，随着国内猪场养殖密度提高及环境的变化，PR的发病率呈明显上升趋势，并出现新的流行特点：流行范围广，国内多个省份的PRV野毒感染严重；多数规模化猪场突发，蔓延迅速，疫情严重。不同日龄阶段的猪均可感染，尤以母猪流产、产死胎和新生仔猪典型的神经症状为主要特征，发病率和病死率显著升高[7-8]，育肥猪呼吸道症状严重常继发其他病原混合感染，造成呼吸综合征；传播方式多样化，除了主要的空气传播，还有通过带毒猪排毒的水平传播和胎盘垂直传播；多种动物易感PRV；现有疫苗保护效果不佳，此次PR的暴发主要发生在许多传统疫苗免疫接种的猪场。

尤以2011年底以来，国内各地区突然暴发PR，迅速传播，多数猪场PRV感染率或gE抗体阳性率增加20%～50%[9]，逐年上升，更加难以控制，对养猪业造成严重的影响。全炎铭等[10]对2011年—2016年北京地区PRV野毒感染情况研究表明，2011年以前感染率较低，从2012年开始迅速上升，2013年PRV野毒抗体阳性率上升到38.99%，而2016年则达到最高40.08%。李琰[11]采用PRV-gE抗体ELISA对2015年—2016河南地区某猪场血液样品进行检测，结果不同发育阶段猪群检测的PRV-gE抗体阳性率具有较大的差异，以种母猪阳性率最高达68.99%，而育肥猪和种公猪分别为44.07%和39.68%，仔猪和保育猪分别为12.92%和27.66%，这表明种猪引进时带毒且持续存在，严重危害养猪业的发展。黄晓慧等[12]对2012年—2015安徽省不同规模化猪场的血清样品进行PRV抗体检测，表明血清阳性率逐年上升，2015年最高达26,61%；另外猪场总阳性率为41.96%，其中育肥猪和母猪高达31.02%和27.46%，表明该地区猪群带毒猪持续存在，导致PRV感染严重。党占国等[13]对2012年—2015年河南地区的猪场进行PRV野毒抗体检测，结果表明，PRV gE抗体阳性率不断上升，尤其2015年血清阳性率达70.24%，说明近4年内PRV感染率呈逐年增长趋势，成为国内猪场疫病防控的一个难点。王金涛等[14]对2015年辽宁省3个规模化猪场的血清样品进行PRV抗体检测，其中猪场2和猪场3 PRV野毒感染较严重，感染率分别达到56%和78%，表明辽宁省不同规模化猪场PRV野毒感染普遍存在，应加强PR的防控工作。杨珊珊等[15]采用ELISA对2016年江苏省不同规模化猪场的血清样品进行检测，猪场PRV野毒抗体阳性率为94.6%，其中公猪野毒感染阳性率55%，后备母猪野毒感染阳性率达69.4%，经产母猪野毒阳性率为44%，表明PR在江苏省流行广泛，野毒感染严重，尤其种猪群感染较严重，应加强引种检测及疫苗免疫等措施。以上调查结果均表明国内多个省份的PRV野毒感染率大幅度升高，并呈逐年上升趋势，严重危害我国养猪业的发展。

1.1　猪伪狂犬病病毒流行变异株的致病性

1.1.1临床症状PRV流行变异毒株感染猪后，不同阶段的感染猪都呈显性感染，表现不同的临床症状，感染母猪流产，哺乳仔猪、生长育肥猪均表现高热、呼吸困难及神经症状等，发病率和病死率均高。其中以母猪产死胎以及伴有神经系统障碍的弱仔猪死亡等为主要特征，表现为妊娠母猪发生整窝流产、死胎，产仔数减少；新生仔猪则呈现转圈、抽搐、四肢划水等神经症状。

1.1.2病理变化流行变异毒株感染猪后，剖检呈现严重的病理变化，如脑膜充血、出血水肿，脑脊液增多；肝脏和脾脏有黄白色坏死结节，扁桃体和肺水肿，淋巴结和肾脏出血等典型的病理变化，尤其是哺乳仔猪发生病毒性心肌炎时，心肌变性呈灰色，甚至心肌坏死。

1.1.3疫苗保护效果李冬宝等[16]进行的免疫保护试验中，Bartha-K61疫苗对感染PRV经典SC毒株能提供有效保护，而对感染新型变异株TJ株不能提供完全的保护，与SC经典株相比，其变异株致病性增强。该试验表明，传统Bartha-K61疫苗不能对中国现流行的新型PRV变异株的感染提供有效的保护，新分离的PRV变异毒株毒力可能发生变化。Yang Q Y等[17]进行的致病性试验表明，新型PRV变异株HN1201毒力明显强于经典Fa毒株。虽然接种传统疫苗有助于预防疾病，但并不能妨碍野生型强毒株的感染。毒力变化可能与传统疫苗免疫猪场再次暴发伪狂犬病有关。

1.2　猪伪狂犬病病毒流行变异株的抗原性差异

杨文萍等[18]血清抗体检测结果显示，与传统毒株LA株间的中和效价明显高于新流行毒株ZJ01之间的中和效价，其变异系数为0.279～0.413，表明国内分离的新型流行变异毒株抗原性发生较大的变异。屈锋等[19]采用中和试验进行血清学检测，Bartha-K61免疫接种猪产生的中和抗体水平较低，而对新分离的病毒接种猪血清产生的抗体水平较高，表明当前流行的PPV变异毒株和疫苗株之间抗原性上存在一定的差异。因此，抗原差异也可能是导致传统疫苗免疫猪群再次暴发伪狂犬病的原因。

1.3　猪伪狂犬病毒流行变异株的分子特征的差异

近几年，通过对PRV的毒力相关和抗原基因的序列分析，发现我国各省分离的PRV流行毒株与国外分离的其他毒株存在明显的差异。Ye C等[20]系统进化树分析表明，国内新流行毒株与亚洲分离PRV毒株属于同一基因型，处于一个相对独立的分支，亲缘关系较近，而欧美PRV毒株属于另一基因型，亲缘关系相对较远。由此表明，国外经典毒株为基因Ⅰ型，国内流行株为基因Ⅱ型，这可能是导致传统疫苗对流行毒株保护效果不理想的原因。姜平[21]表明，新暴发的PR的病原在原PRV的基础上发生了重组变异，形成了新的强毒株，与以前的PRV流行毒株相比，新流行毒株在基因和蛋白水平上发生了变异，包括大多数病毒蛋白发生的碱基替换、插入和缺失。据陈秋勇等[22]和Fan J等[23]报道，关于PRV各基因氨基酸变异位点分析，发现PRV变异株gE基因与国内外其他毒株的gE基因有2个明显氨基酸变异位点。即第48位点插入1个天冬氨酸(D)，第496位点亦插入1个天冬氨酸(D)。此外，糖蛋白gB在75-77处有3个氨基酸的缺失，在94处有1个氨基酸的插入。糖蛋白gD在278-279处插入2个氨基酸。糖蛋白gI在172位缺失1个氨基酸,在238位插入1个氨基酸。糖蛋白gC在63-67位插入7个氨基酸(AAASTPA)，还有UL2、UL5、 UL12、UL13、UL50及IE180等基因都有氨基酸插入等变化。以上表明PRV新流行毒株的多个毒力相关基因和抗原基因发生了变异，导致其毒力和抗原性发生差异。综上所述，与经典毒株相比，PRV变异毒株毒力增强与抗原变异使传统Bartha-K61疫苗在抵抗强PRV毒株入侵时，不能足以提供完全的保护，这可能是导致其免疫猪场再次发生猪伪狂犬病的主要原因。

2　猪伪狂犬病疫苗的应用

疫苗免疫接种是控制伪狂犬病最重要的措施。早期常规疫苗主要是灭活和传统弱毒活疫苗，这两种疫苗在防控PR方面起到了一定作用。但灭活疫苗免疫效率低，成本高且用量大；传统弱毒活疫苗安全性差，有恢复毒力的潜在危险。因此，为防止伪狂犬病病毒的感染，许多基因工程疫苗已经陆续开发，包括亚单位疫苗、核酸疫苗、基因重组载体疫苗以及基因缺失疫苗，其中基因缺失弱毒疫苗己经相对成熟，其他基因工程疫苗尚处于研究阶段。

2.1　基因工程疫苗

2.1.1亚单位疫苗国内Ye L L等[24]制备的ISCOM亚单位疫苗100 LD50剂量的PRV闽A株攻毒保护率为100%。Marchioli等将PRV保护性抗原基因gD克隆pSV2dhfr 载体免疫接种猪，诱导猪产生中和抗体以抵抗PRV强毒株的攻击。gD在痘苗病毒启动子P7.5控制下的TK基因位点高效表达。亚单位疫苗安全性高、性能稳定、便于运输和保存；同时还可以减少或消除早期常规疫苗难以避免的各种有害的反应原。但是制作成本高，免疫原性效果较差，临床应用受到限制。

2.1.2核酸(DNA)疫苗Xiao S等[25]研究了结合Semliki forest病毒(SFV)复制子并表达伪狂犬病病毒(PRV)的糖蛋白C(gC)的自杀DNA疫苗(pSFVC1.5)。Montail等构建了含PRV gD基因的真核表达质粒DNA疫苗，接种仔猪显示,未免疫仔猪和免疫仔猪均能够产生中等程度的中和抗体。gD基因在SV40早期启动子控制下,构建的重组质粒可诱导gD抗体产生,保护小鼠免遭PRV强毒的致死攻击。核酸疫苗免疫能克服PRV潜在感染，激发细胞免疫,安全性高，无病原微生物，操作简单,成本低廉。虽然免疫疫苗能诱导产生较高水平的抗体，但对某些强毒的攻击仅能起到部分保护性，仍不能完全阻止野毒入侵，应用上也受一定的限制。

2.1.3PRV重组活载体疫苗目前国内已报道重组伪狂犬病病毒活载体疫苗主要有表达CSFV的E2基因、表达FMDV的VP1基因、表达JEV的NS1基因，以及表达PRRSV的GP5基因的重组伪狂犬病病毒。Lei J L等[26]以rPRVTJ-delgE/gI/TK作为弱毒疫苗载体构建了rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2，具有安全性，对TJ的攻击可提供保护。Wang Y M等[27]构建了表达CSFV的E2基因的新的重组PRV变体(rPRVTJ-delgE/gI-E2)，对猪只检测的抗PRV和抗CSFV中和抗体是安全的，并且通过PRV TJ毒株或CSFV毒株提供了完全保护，免受致死性攻击。因此，该疫苗基因组大，能容纳较大的外源基因，安全性好，免疫原性持久，宿主范围广，该疫苗还可以减少给动物机体带来的应激，以及加强免疫程序，能节约成本。该类疫苗的应用可以作为两种或两种以上病毒共感染的二价或三价候选疫苗，为疫病防控提供良好的发展前景。

2.2　基因缺失疫苗的应用

随着分子生物学技术与基因工程技术日益成熟，基因缺失疫苗的研制成为重要研究的热点。多数PRV基因缺失株是以其毒力基因以及部分囊膜糖蛋白为主进行缺失如TK、PK、RR、gG、gE、gC、gD和gI等基因。目前国内外已构建出多种基因缺失疫苗，有如单基因、双基因和多基因缺失疫苗，对于猪伪狂犬病的控制和根除起着有效的作用。

2.2.1基因缺失疫苗基因缺失疫苗是当前基因工程疫苗研究的重要方向之一。国内外许多学者研制了基因缺失苗，如Zhu L等[28]构建了TK/gE、TK/gC、TK/gG双基因缺失疫苗株及gE/gI/TK三基因缺失等。He Q G等[29]构建了PRV Ea株的TK/gG 、TK/gE等双基因缺失疫苗株。Kit S等[30]构建出PRV的TK基因缺失疫苗株以及PRV TK/gC双基因缺失疫苗株。PRV基因缺失疫苗株的成功研制，为今后PRV基因工程疫苗的研制打下了良好的基础，同时结合相应的ELISA检测方法，使得PRV基因缺失疫苗在大多数国家猪伪狂犬病的根除计划中起着关键的作用。

2.2.2单基因缺失疫苗第一代基因缺失疫苗是以PRV BUK疫苗株为亲本，构建出PRV的TK基因缺失的PRV BUK-dl3株，该缺失株于1986年被美国批准上市。之后，国内研究者也逐渐构建出许多基因缺失株，如一些缺失株TK、gE、PK、gD、gG、RR等毒力和抗原性基因的缺失，但由于单个基因的缺失，不能有效的区分人工免疫和自然感染动物或出现毒力返强现象，所以目前对于单个基因缺失的应用有所限制，需要在此基础上再缺失其他相应的基因。

2.2.3双基因与多基因缺失疫苗在第一代基因缺失疫苗的基础上，Kit等在PRV BUK-dl3株的基础上构建了PRV TK/gC双基因缺失疫苗株，该疫苗可用来区分自然感染和免疫动物。此后，Moormann等构建了TK/gI双基因缺失疫苗株。陈焕春等构建了PRV Ea TK-/gG-、TK-/gE-疫苗株，其中TK-/gG-双基因缺失疫苗株(HB-98)，2006年获得国家新兽医药注册证书。郭万柱等构建了PRV闽A株TK-/g-、TK-/gE-、TK-/gG-双基因缺失株以及gE/gI/TK三基因缺失疫苗株(SA215)， 2003年获得国家新兽药证书，它是中国第一个基因工程疫苗。此外，一些研究者也构建了其他多基因缺失株，如Mettenleiter等构建了gC-/gE-/gI-/gG-和gD-/gE-/gI-/gG-四基因缺失疫苗株。近年来由于新PRV发生变异，导致这些疫苗的保护效力不足以抵抗变异毒株的攻击，因此，必须针对变异毒株进行新型疫苗的研究。

2.2.4流行变异株的基因缺失疫苗Gu Z等[31]利用BAC克隆技术在PRV ZJ01株基础上构建的的VZJ01△gE/gI双基因缺失疫苗株，免疫试验表明，该缺失疫苗对变异株ZJ01的攻击可提供完全保护。Wu T等[32]以JS-2012株为亲本，构建了JS-2012-△gE/gI双基因缺失株，试验表明该缺失株对于新型毒株JS-2012可提供完全保护。Cong X等[33]在rPRV TJ-delgE/gI缺失株基础上构建gE/gI/TK三基因缺失疫苗株，试验表明对于新型毒株TJ的攻击能提供完全保护，与rPRV TJ-delgE/gI相比更具有安全性。Zhang C等[34]利用BAC克隆技术构建了的TK/gE/gI三基因缺失疫苗株，动物试验表明可产生特异性抗体，且对新型毒株的攻击可提供完全保护。这些疫苗都证明能够使免疫猪抵抗新型PRV变异株的攻击，以提供有效的免疫保护，可作为有效的候选疫苗。这类基因缺失疫苗的成功研制，在猪伪狂犬病预防和控制中具有非常重要意义。

3　小结与展望

近年来，多数PR阴性猪场野毒感染情况严重并呈大幅度上升，严重危害养猪业发展。由于猪伪狂犬病病毒变异毒株毒力增强和抗原变异，是导致猪伪狂犬病再次暴发的主要原因[35-36]；其次，猪群感染猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒等[37]免疫抑制性病毒，使猪群对其他病原的抵抗力降低，导致疫苗免疫效力降低；再者，猪是PRV主要的储存宿主，潜伏感染易被忽视而导致长期体内带毒和排毒，尤其在引种过程时未进行严格检疫，造成猪群有野毒的存在；猪群免疫不到位，免疫程序不合理、疫苗选择不科学或疫苗质量差、免疫剂量使用不当等因素也会导致机体的免疫应答减弱，从而造成免疫失败。由于传统的猪伪狂犬病疫苗对新型PRV变异毒株不能提供有效的保护，并存在一定的安全隐患，控制和根除猪伪狂犬病仍是必须努力的方向。因此，迫切需要研制一种针对当前PRV流行变异毒株的新型疫苗，以防控新变异毒株的流行。此外，猪场也要实施有效的免疫方案，加强饲养管理和生物安全的管理措施，以减少混合感染及猪群内野毒感染率。

随着分子生物学和基因工程技术的不断探索和创新，对于猪伪狂犬病新型疫苗的研究，将会有越来越多的基因工程疫苗应用于生产中。总而言之，研制无致病性、无潜伏感染、安全有效的新型高效疫苗，是今后研究的主要方向，为实现猪伪狂犬病净化和根除的计划提供技术支撑。