猪流行性腹泻研究概况

周宏专

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京 100097)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起猪腹泻的重要病原之一，各种年龄的猪均易感，对哺乳仔猪危害更大，发病率可达80%～100%，发病猪临床特征主要为腹泻、呕吐和脱水。近年来，高毒力PEDV变异株的出现，给中国乃至世界养猪业造成了极大的经济损失[1]，急需畜牧兽医行业特别是科研人员重新认识该病原的致病机理和危害。基于此，对猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)国内外近期研究进展如流行病学、病原学、诊断及防控措施等进行综述，以期为该病的防控提供参考。

1　病毒起源

猪流行性腹泻于1971年首次在英国报道，随后在比利时、荷兰、德国、法国、瑞士、保加利亚和匈牙利等国家也都有相关的发病报道，欧洲于2000年逐渐控制了该病。目前，该病在中国、韩国和日本较为流行[1]。我国于1973年首次报道该病，1984年成功分离鉴定其病原PEDV。此后，该病在国内逐步蔓延，采用猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎灭活苗或弱毒二联疫苗预防该病则始于1995年，但有报道称从2006年开始，出现免疫效果不理想的现象，免疫过的猪群仍可能暴发PED。

2　流行现状

2010年10月，中国南部地区暴发严重的猪流行性腹泻疫情，虽然基于经典的CV777毒株的疫苗在国内被广泛使用，但新生仔猪的致死率仍高达50%～100%，表明可能出现了高毒力的PEDV毒株，随后国内多个地区均暴发了PED疫情，经济损失较大。2013年4月，美国首次报道猪场出现高毒力PEDV，到2015年3月中旬，疫情已扩散至美国36个州。据估计，2014年PED疫情的大规模暴发，年净亏损达到90～180亿美元[2]。继中国和美国暴发大规模PED疫情之后，国内除西藏外均有PEDV被检出的报道[1,3]，欧洲(英国、德国、荷兰、比利时、奥地利、乌克兰、意大利、葡萄牙、法国、捷克、斯洛文尼亚、匈牙利)、亚洲(韩国、日本、菲律宾、越南、泰国)、美洲(加拿大、墨西哥、多米尼加、哥伦比亚、秘鲁)近期也都检测出PEDV[2,4]。

3　病原学

3.1　病毒基本特征

PEDV属于套式病毒目(Nidovirales) 冠状病毒科(Coronaviridae) 冠状病毒属(Coronavirus) ，为有囊膜、单股、正链RNA病毒。病毒粒子呈球形，有囊膜，囊膜上覆盖有纤突，粪便中的病毒粒子形态多样，病毒直径约95 nm～190 nm[5]。

3.2　基因组结构

PEDV基因组RNA全长约28 kb，从5′ 帽子结构(cap)到3′poly A尾，PEDV基因组RNA包括7个编码病毒蛋白的开放阅读框(open reading frames,ORF)，分别为复制酶多聚蛋白基因(replicase,Rep)、纤突蛋白基因(spike protein,S)、ORF3 基因、包膜蛋白基因(envelope protein,E)、膜蛋白基因(membrane protein,M)及核衣壳蛋白基因(nucleocapsid protein,N)，基因顺序为5′ -Rep(ORF1a和ORF1b)-S-ORF3-E-M-N-3′[6]。ORF1a和ORF1b编码病毒聚合酶，由不同的核糖体移码机制翻译ORF1形成2个相互重叠的阅读框，重叠区存在ORF1b翻译所需要的7个核苷酸滑动序列以及假节结构；ORF1a编码蛋白有蛋白酶功能，ORF1b编码蛋白有RNA依赖的RNA聚合酶、核酸外切酶，内切核糖核酸酶和甲基转移酶功能。ORF3编码功能不明的非结构蛋白质，该蛋白与病毒致病性有关。S蛋白为Ⅰ型糖蛋白，由2个亚结构域S1和S2组成，S1与病毒中和和遗传多样性至关重要，S蛋白在病毒与宿主受体相互作用和病毒进入宿主细胞中具有重要作用。E蛋白与M蛋白结合，影响病毒粒子的组装与病毒的释放。M蛋白除参与病毒组装外，还与病毒中和相关，在感染后可诱导α干扰素的产生。N蛋白为磷酸化蛋白，常用于PEDV感染的检测[6]。

3.3　病毒分型及变异株

PEDV疫情的蔓延引起了研究人员的广泛关注，不断有新的PEDV全基因组序列公布，截至到2017年10月中旬，NCBI已经公布了452条全基因组信息。Wang D等[1]通过对公布的全基因组序列分析比对认为，PEDV可以分为2个基因型，G1型(经典型)和G2型(变异型)，每个基因型又包括2个亚型，分别为G1a、G1b、G2a和G2b，此外还有重组R型(recombinant R)。

由于PEDV基因序列较多，对某些重组毒株的基因型划分可能会略有不同。2010年之后，中国流行的PEDV毒株包括G1b和G2型，与经典的CV777毒株基因型不同[5]。研究表明2013年美国出现的毒株来源于AH2012和CH/ZMDZY/11的重组，属于G2a亚型。此类毒株与日本及韩国2013年后期分离的G2a亚型毒株可能存在关联[5]。而2014年德国暴发的PEDV及此后法国和比利时的流行毒株与中国、美国和韩国的部分R型(重组型)毒株关系较近[5]。Kim等通过对韩国2007年至2010年分离毒株的E和M蛋白编码基因分析发现，这些毒株与美国流行的USA/Colorado/2013属于同一进化分支。Wang D等[1]分析了美国USA/Colorado/2013株、中国AH2012株及2010年5月至2011年5月韩国分离株的E蛋白编码基因，发现分离毒株进化上属于韩国毒株所在基因型组。提示美国的PEDV流行毒株与韩国早期毒株存在相关性。

通过基因插入、缺失和重组产生了较多PEDV变异株。毒株的变异可能与毒力强弱或适应宿主环境有关。根据Lin C M等[4]的研究，非S蛋白插入和缺失 (non-S insertions and deletions,non-S INDEL)毒株毒力强，发生S蛋白插入缺失的INDEL毒株毒力稍弱，但在某些情况下仍可致病。Wang等报道的美国OH851 S INDEL毒株，在S蛋白N端含1个氨基酸(aa161-162)的插入和2处氨基酸(aa59-62和aa140)的缺失，毒力与non-S INDEL相比有所减弱。Zhang等报道的中国CHN/FL2013株在S蛋白发生了7aa的提前终止，毒力也出现了降低。此外，韩国的MF3809/2008及日本的JPN/Tottori2/2014为S蛋白大片段缺失株，分别缺失204aa (aa713-916)和194aa (aa23-216)，但其毒力情况尚未见报道。类似的缺失还发生在ORF1a，如越南HUA-14PED96/2014毒株的ORF1a在nsp3处缺失24aa。除插入缺失外，PEDV也会发生重组，如USA/Iowa106/2013毒株可能来自于CHN/AH2012、CHN/ZMDZY/2011和CHN/CH/S/1986的多次重组。Boniotti等及Akimkin等报道了传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和PEDV毒株以TGEV为骨架结合PEDV的S编码基因重组，产生了新的病毒SeCoV (swine enteric，CoV)，即意大利的Italy/213306/2009毒株和德国的GER/L00930/2012毒株，但其毒力有待进一步鉴定。

3.4　致病机理

PEDV致病机理的研究涉及病毒及宿主细胞相互作用的诸多生物学环节。有研究表明，紧密连接蛋白occludin(闭合蛋白)是PEDV后期进入宿主细胞的关键因子之一，在巨胞饮所致的occludin内化过程中起作用[7]。Liu C等[8]认为溶酶体半胱氨酸蛋白酶(lysosomal proteases)激活了S蛋白，进而导致PEDV进入宿主细胞。

PEDV进入细胞后，病毒蛋白调节多个信号通路参与了病毒的复制增殖，如p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和c-Jun N-端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK )可以在PEDV进入宿主细胞早期起促进病毒感染的作用[9]。胞外调节蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases,ERK)通路的活化有助于病毒的复制，抑制该通路的活化可导致病毒转录及蛋白表达的减少[10]。而磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合酶激酶3α/β (phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B/glycogen synthase kinase-3α/β,PI3K/Akt/GSK-3α/β)信号通路的激活，可能起到抑制PEDV复制作用[11]。Jaruampornpan P等[12]发现，PEDV在感染过程中通过编码的3C-like蛋白酶(3C-like protease,3Cpro)切割N蛋白(切割位点位于C端)，同时N蛋白能够被水解切割的PEDV与N蛋白不能够被水解切割的重组PEDV相比具有复制优势。N蛋白与核仁磷蛋白 (nucleophosmin,NPM1)相互作用可以阻止其被半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3 (cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)水解切割，增强细胞存活，进而促进PEDV复制[13]。

PEDV能够通过多种机制抑制干扰素的产生，而逃避宿主的抗病毒反应。在此过程中有多个编码蛋白参与了抑制干扰素产生的过程。如复制酶基因编码的PLP2蛋白(papain-like protease)可使维甲酸诱导基因-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ,RIG-Ⅰ)和干扰素刺激基因(stimulator of interferon genes,STING)去泛素化，干扰RIG-Ⅰ和STING介导的信号传导途径，抑制干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)的核转移，从而抑制β干扰素 (interferon-β,IFN-β)的合成[10]。Zhang Q等[10]研究表明,非结构蛋白 (nonstructural proteins,nsps) nsp1、nsp3、nsp7、nsp14、nsp15、nsp16、ORF3、E蛋白、M蛋白和N蛋白都能抑制IFN-β的产生及IRF3启动子的激活。其中，nsp1不影响IRF3的磷酸化和核转移，但可以降解CREB结合蛋白 (CREB-binding protein,CBP)，进而影响IRF3和CBP的装配，还干扰IκB的磷酸化和降解，阻止p65的激活并抑制正调节域Ⅱ(positive regulatory domains Ⅱ,PRD Ⅱ)介导的核转录因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)活性[10]。此外，nsp5具有半胱氨酸蛋白酶活性，能够切割NF-κB的重要调节因子(NF-κB essential modulator,NEMO)，干扰RIG-Ⅰ/黑素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA5)信号途径，抑制干扰素的产生[14]。N蛋白在天然免疫应答中也起到了重要作用，Ding Z等[15]研究表明,N蛋白与TANK结合激酶1 (TANK binding kinase 1,TBK1)作用，阻隔其与IRF3的作用，使其不能磷酸化和核转移，从而拮抗IFN的产生。也有研究发现,在猪小肠上皮细胞(small intestine epithelial cells，SIECs)中，PEDV感染通过Toll样受体(Toll-like receptor) 2、TLR3和TLR9途径激活NF-kappaB，进一步的研究发现TLR2参与了N蛋白诱导的NF-κB的激活[10]。除此之外，PEDV感染过程中RIG-Ⅰ介导途径中的线粒体抗病毒信号蛋白 (mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS)的活化，信号转导和转录激活因子1 (signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)依赖蛋白酶体方式的降解及热休克蛋白27 (heat shock protein 27,HSP27)表达的下调，均可抑制干扰素信号的应答反应[10,16-17]。

PEDV的感染也有炎性反应及自噬的发生。Xu X等发现N蛋白可延长细胞周期的S期从而抑制小肠上皮细胞的生长，并且刺激上皮细胞高水平表达白介素-8 (interleukin 8,IL-8)，促进炎症反应。PEDV还可通过N蛋白与CCAAT/增强子结合蛋白-β (CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBP-β)相互作用，结合于重要的促炎症反应因子高迁移率族1 (high mobility group box 1,HMGB1)的启动子区，诱导了HMGB1的转录和乙酰化修饰释放[18]。Guo X等[19]发现在PEDV感染过程中，自噬与炎性因子的表达相关，且与NF-κB信号通路形成正反馈调节回路。

4　病毒实验室检测方法

4.1　病毒分离培养

病毒分离培养鉴定周期长，操作程序繁杂，但仍是病毒病的主要诊断手段之一，其结果准确、可靠。分离时可采集具有腹泻症状的发病猪空肠及肠内容物，重悬、离心过滤后接种于细胞系上。PEDV的分离仍有一定难度，分离过程需要在细胞培养基中添加一定量的胰酶；常用的分离细胞系包括Vero (CCL-81)、Vero E6 (C1008)和IECs(ileum)。Choudhury B等[2]认为Vero (CCL-81)分离效果较好；此外，使用表达PEDV受体猪氨基肽酶N (procine aminopeptidase N,pAPN)和跨膜Ⅱ型丝氨酸蛋白酶2 (transmembrane type Ⅱ serine protease 2,TMPRSS2)的细胞系，可以促进病毒的增殖[20]，可能会提高分离成功率。

4.2　反转录-聚合酶链反应

反转录-聚合酶链反应 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)作为实验室常用的分子检测方法之一，目前已有很多研究报道，根据设计的不同还可以分为传统RT-PCR、套式RT-PCR (nested RT-PCR)、多重RT-PCR (multiplex RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR (real-time PCR，RT-qPCR)。也有学者开发了多重RT-PCR,用于区分多个病毒的感染。Zhao等成功建立了能区分PEDV、TGEV、A型轮状病毒(Porcine group A rotaviruses,GAR)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)4种病毒的多重RT-PCR方法[21]。Xing N等[22]使用功能化的磁珠-纳米金颗粒(functionalized nanoparticles-based PCR method,UNDP-PCR)辅助检测，对比试验表明，其灵敏度比普通RT-PCR提高了400倍。

4.3　反转录-环介导等温扩增

反转录-环介导等温扩增(reverse transcriptase-loop mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法操作简单、特异强、性价比高。Gou H等[23]针对PEDV M基因设计引物并建立RT-LAMP方法，使用密封的一次性含垂直放置的核酸检测试纸的检测盒,用于降低污染并提高特异性。所建立的RT-LAMP方法的灵敏性高于传统的RT-PCR。

4.4　酶联免疫吸附试验

已经有多项针对PEDV的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)方法，主要包括间接ELISA和竞争性ELISA。分别用全病毒或重组S、N和M蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法[21]。Okda F等[24]用针对N蛋白的单克隆抗体，建立了竞争阻断ELISA方法，认为竞争阻断ELISA敏感性和特异性好，适合用于临床常规检测。

4.5　免疫胶体金技术

免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique)是一种快速、简便、结果易判读、适合基层快速检测的一种技术。Song D等[6]报道了针对N蛋白抗原的免疫层析试纸条，胶体金免疫层析试纸条检测的灵敏性与ELISA方法相当，略低于RT-PCR，但可以在10 min内得到检测结果，适合有快速检测需求时使用。

4.6　新型检测方法

Okda F等[24]使用偶联PEDV重组N蛋白的微球结合双激光Bio-Plex 200仪器，建立了荧光微球免疫法(fluorescent microsphere immunoassay,FMIA)。与传统的ELISA相比，该方法灵敏度高、通量高、可多重检测，在单一样品中可同时检测多种病原体。此外，还利用针对PEDV N蛋白的单克隆抗体SD6-29建立了荧光聚焦中和法(fluorescent focus neutralization,FFN)，可以测定血清、奶或初乳样品中PEDV功能性中和抗体的相对量，为疫苗或保护性免疫的评价提供了有效工具。

5　预防与控制

5.1　综合防控措施

主要包括改善环境，加强管理。对于母猪要保证饲料质量，防止霉菌毒素污染，注意环境卫生，控制产房温度和湿度，力争实行全进全出，禁止在母猪妊娠后期和哺乳期滥用保健药物。对于仔猪要减少应激，合理免疫。疫病流行期间，要禁止可能接触到病原的人或工具进入到猪场，并果断隔离加强消毒[5]。条件允许的猪场可以建立猪场疫病诊断和预警系统为疫病的防控提供参考。

5.2　特异性免疫

新生仔猪在面临急性病毒感染时，通常无法及时产生主动免疫应答，而妊娠期间从胎盘获得的抗体不足以抵抗病毒，所以PED的预防主要依靠加强母猪免疫，依靠从初乳和母乳中获得的母源抗体为仔猪提供保护[20]。

目前国内获得农业部注册的PED疫苗有3种，2014年12月公告的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)，2015年11月公告的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗(HB08株+ZJ08株)，2016年10月公告的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(WH-1株+AJ1102株)[1]。所使用的毒株包括CV777、ZJ08和AJ1102，另外还有针对AJ1102-R、HZ、CHYJ和XJ-DB2的疫苗在临床试验阶段。韩国有早期针对PEDV DR13及KPED-9毒株的疫苗，日本还有针对P-5V毒株的疫苗[25]。除此之外，美国自2013年暴发PEDV疫情以来，有2种商用疫苗，HarrisvaccinesTM公司2014年6月获批的用复制缺陷的委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)整合PEDV S蛋白编码基因长片段，包装而成的iPED+疫苗和Zoetis Inc 2014年9月获批的PEDV全病毒灭活疫苗[26]。

除传统疫苗外，Pyo等将具有中和PEDV活性的单克隆抗体2C10的重链和轻链可变区扩增连接形成单链片段(single-chain Fvs,scFv)，优化后使用大肠埃希菌表达系统表达，所表达的scFv保留了亲本抗体的功能，体外能够阻断PEDV感染靶细胞，该结果展现了单链抗体作为新型免疫制剂的潜能。Lee C等[5]分别使用重组的S1蛋白免疫鸡，刺激鸡产生卵黄抗体(IgY)，用提取的IgY通过口服途径用于仔猪，卵黄抗体能够使新生仔猪抵抗PEDV的感染，是潜在的预防和治疗制剂。

随着基因工程技术的发展，研究人员还使用多种表达系统及技术手段尝试研发新型基因工程疫苗。如以杆状病毒、腺病毒及痘病毒为载体表达PEDV相关片段；使用减毒鼠伤寒沙门菌及使用乳酸菌进行PEDV基因原核表达；使用酵母进行相关片段表达；使用真核表达载体如pVAX1制备核酸疫苗；使用转基因技术制备植物口服疫苗等[25]。但大多处于实验室阶段，免疫保护效果及应用潜力仍有待进一步完善和评估。

值得一提的是，从Bohl等在猪中发现肠-乳腺-SIgA轴这一现象起，黏膜免疫在肠道疾病免疫预防中的作用逐渐得到重视，初乳和母乳中的SIgA以及PEDV中和抗体滴度可能与PEDV的保护性免疫有关。因此，研发针对怀孕或哺乳母猪的疫苗诱导黏膜免疫是非常实用的[26]。

5.3　非特异性药物

除疫苗相关研究外，研究人员也对相关生物制剂、药物、植物提取物、小分子和抑制剂等在PED治疗中的作用进行了评估。主要包括表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)[5]、纳巴霉素[27]、NIH收集的已经通过临床试验的化合物六氯酚、硝唑尼特和高三尖杉酯碱[28]、复方术芩提取液、银杏果皮多糖提取物、山茶花中的齐墩果烷三萜[29]、药草提取物(蒲公英，堇菜，黄连和黄芪)[30]、野菊花中的部分倍半萜类化合物[31]、甘草根提取物[32]、七叶树种子提取物[33]、链霉菌代谢物xiamycin D[34]以及针对主要蛋白酶的拟肽抑制剂[35]等。这些研究为未来PED的治疗提供潜在的技术手段。

6　小结

近年来PEDV流行较为普遍，已经报道的毒株序列分析显示其基因型多为G2型，同时毒株之间还会发生重组产生新的变异株，给PED的防控带来了巨大挑战。为更好的防控该病，应该加强对临床样品的监测，关注病毒重组与肠道病毒共感染情况，评估变异株的流行及毒力情况，降低病原对养猪业的损失。进一步加强对PEDV逃避宿主免疫机理的研究，阐明PEDV强弱毒株致病性的差异机制，毒株间交叉保护的可能性，为研发新型疫苗奠定基础。此外，还需要根据怀孕或哺乳母猪特殊的激素水平情况，研发针对怀孕或哺乳母猪的疫苗，进一步提高疫苗诱导黏膜免疫的效率，以期为仔猪提供更好的保护。除使用疫苗之外，生物安全防护及饲养管理对于PED的防控也非常重要。