8‰低盐度海水暂养 对中华绒螯蟹雌蟹肌肉滋味品质的影响

王丹青,张 龙,吴旭干,王锡昌,*,李元阳

(1.上海海洋大学食品学院,上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;2.上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis,俗称河蟹)是全球最主要的经济蟹类之一,其产量在2005年后稳居世界经济蟹类第一。随着中华绒螯蟹养殖各种技术难题的攻克,使得金秋时节的赏月品蟹逐步走进了寻常百姓家。然而如何在稳定、高产的背景下推动中华绒螯蟹品质的提升,完成养殖中华绒螯蟹“数量型”到“质量型”的生产方式转变,进一步挖掘其更高的经济价值是当下亟待解决的问题之一,也是学者们探讨和研究的热点。在其成为商品蟹上市前进行一段时间的暂养,即可从一定程度上解决上述问题。

暂养也称囤养,是将养殖或野生水体捕获的水产品活体转入人工控制条件下的小面积场地,经过短期饲养后再作为商品出售的一种养殖形式。暂养方式多样,而且从现阶段的研究中可以看出销售前的短期暂养可以改善水产品的肉质,口感以及品质等[1-5]。当水体环境发生改变时,生物体出于个体生存的本性,会根据周围环境的变化做出适当的调整和改变,如改变鱼、虾和蟹等水生生物养殖水体的盐度会影响他们的渗透压调节[6],进而影响到其自身的生长、新陈代谢等能力,营养和风味等食用品质也随之受影响[7]。

中华绒螯蟹作为广盐性甲壳动物,其在生殖脱壳后需要生殖洄游,在咸水中完成亲蟹的交配、产卵、孵化等。基于中华绒螯蟹在性腺发育时对水体盐度的趋向性,在水体盐度的刺激下育肥的中华绒螯蟹可食比例得到提升,营养品质提高。高盐度(18‰)能够明显提升中华绒螯蟹氨基酸的必需氨基酸指数,但也会显著降低其DHA、EPA 等高度不饱和脂肪酸的含量。中、低盐度(6‰、12‰)下肝胰腺的多数营养指标与无盐度组并无显著差异,但其部分矿物质元素和高不饱和脂肪酸的含量亦有所提升[8]。由于暂养条件及设备条件的限制,选取中低盐度(8‰)作为本实验中8‰低盐度海水暂养的条件。基于中华绒螯蟹在性腺发育时对水体盐度的趋向性,提高中华绒螯蟹在育肥阶段的水体盐度,能够促进性腺的发育并对其肝胰腺的主要营养品质造成影响。而且雌蟹和雄蟹肝胰腺的品质对不同盐度的响应也有所不同[9]。一般来说,甲壳动物在饥饿状态下将降低代谢水平以减少自身能量的消耗,中华绒螯蟹在饥饿过程中也存在两个代谢率相对稳定期,出现在饥饿状态下的第一个月[10]。为探讨8‰低盐度海水对中华绒螯蟹滋味品质的影响,本研究采用游离氨基酸、呈味核苷酸及感官评价等指标对中华绒螯蟹的滋味品质进行综合分析,并分析比较强度值(TAV)和味精当量(EUC),对其呈味强度进行评价,进而探明8‰低盐度海水对其滋味品质的作用,为更优质的暂养提供可参考的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中华绒螯蟹雌蟹商品蟹 采自崇明岛,采集时间为2016年10月7日,体质量(91.75±4.17) g;IMP(5′-肌苷酸)标准品、GMP(5′-鸟苷酸)标准品、AMP(5′-腺苷酸)标准品CWN 上海安谱实验科技股份有限公司(中国);针式超滤膜(水相)、自封袋 上海安谱科学仪器有限公司;高氯酸、三氯乙酸、NaOH、KOH AR 国药集团化学试剂公司。

IKA T10型高速匀浆机 德国;Beckman Avanti j-26xp型冷冻离心机 美国;FOSS Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪 丹麦;FOSS Soxtec型全自动索氏抽提系统 丹麦;HITACHI L8800氨基酸自动分析仪 日本;Waters 2695e高效液相色谱仪 美国。

1.2 实验方法

1.2.1 暂养方式及采样方法 于暂养开始前，对蟹的指标进行测定，记为0 d。对于不同水体(0‰、8‰)中华绒螯蟹的暂养开始于10月上旬,雌雄分开,共计12个暂养池,进行暂养,为期21 d。暂养池容量为100 L暂养密度为每暂养池15只,接循环水并保证水的流通且不间断充氧。淡水组水源为曝气后的自来水,盐度为0‰,海水组水源采用天然海水和淡水调配而成。每周分别采集两种水体的雌蟹15只作为实验样品(共计105只)用吸水纸擦干蟹体表水分,抓捕后的中华绒螯蟹用干净的对应盐度的水冲洗2～3次,避免自来水冲洗发生应激反应和对品质的影响。2 h内运回实验室,在沸水锅中蒸20 min。用镊子、剪刀将中华绒螯蟹的体肉及蟹黄(卵巢+肝胰腺)、蟹膏(精巢+肝胰腺)取出,分别混匀后装入密封紧实的自封袋中,置于-40 ℃的冰箱保存,用于各指标检测。

1.2.2 生物学指数 不同水体暂养后生物学指指数,计算如下:

体肉率(%)=肌肉重/体质量×100

蟹黄率(%)=(卵巢重+肝胰腺重)/体质量×100

1.2.3 基本化学组成的测定 水分参照GB 5009.3-2010测定;粗蛋白参照GB 5009.5-2010使用全自动凯氏定氮仪测定;灰分参照GB 5009.4-2010测定;粗脂肪参照GB/T 5009.6-2003使用全自动索氏抽提系统测定。

1.2.4 游离氨基酸的测定 参考Wang等[11]的方法并稍作修改。提取:取适量样品加入15 mL 5%三氯乙酸(TCA)溶液,冰浴下匀浆2 min,超声5 min,静置2 h后4 ℃离心10 min(15000 r/min)。取上清液5 mL,用NaOH溶液(1 mol/mL)调节pH至(2±0.05),后用蒸馏水定容至10 mL。取适量溶液过0.45 μm的水相针式超滤膜后待检测。检测:将制备好的待测液放入自动氨基酸分析仪中在570 nm和440 nm(Pro)下进行检测。

1.2.5 呈味核苷酸的测定 参照Kong等[12]的方法并稍作修改。称(5±0.01) g样品加入30 mL预冷(<4 ℃)的5%高氯酸(PCA)溶液,冰浴下匀浆2 min后超声5 min后4 ℃冷冻离心10 min(15000 r/min)取上清液,沉淀加入10 mL预冷PCA溶液,冰浴下匀浆2 min后超声5 min 4 ℃离心10 min(15000 r/min),合并两次上清液，用事先配好的KOH及PCA溶液调节pH至5.75,上清液定容至50 mL,取适量用0.22 μm微量过滤膜过滤至进样瓶,待测。

HPLC色谱条件如下:色谱柱:岛津Intersil ODS-3(205 mm×4.6 mm);柱温30 ℃;流动相：甲醇(A)和KH2PO4/K2HPO4(2∶1,调节pH至5.75,B);流速：1 mL/min;洗脱程序见表1,洗脱时间30 min;PDA检测器全波段扫描,最终选取248 nm进行数据处理。

表1 高效液相法核苷酸梯度洗脱程序Table 1 HPLC gradient elution program for nucleotide analysis

1.2.6 味道强度值(TAV)及味精当量(EUC) 滋味物质的味道强度值(Taste Activity Value,TAV)的计算公式如下

TAV=C/T

式中,C为滋味物质的绝对浓度值,T为该滋味物质的阈值,详细值见表5;两者在同一单位下进行计算。

味精当量(Equivalent Umami Concentration,EUC)的计算公式如下:

EUC=Σambm+1218(Σambm)(Σanbn)

式中,EUC:味精当量(gMSG/100 g);1218:协同作用常数;am:鲜味氨基酸的浓度(g/100 g);bm:鲜味氨基酸相对于MSG的鲜度系数(Asp为0.077,Glu为1);an:呈味核苷酸的浓度(g/100 g);bn:呈味核苷酸相对于IMP的鲜度系数(其中IMP为1,GMP为2.3,AMP为0.18)。

1.2.7 感官评价方法 挑选已经过培训的感官评定人员7名,3男4女,针对中华绒螯蟹食用的特点及样品可能存在的差异,共对5个滋味指标(鲜味、甜味、苦味、咸味及余味)进行感官强度打分。由于体肉和蟹黄两个部位差别明显,分别打分。根据GB 12313-1990 《感官分析方法风味剖面检验》共分5个强度,分别为0=不存在;1=刚好可识别或阈;2=弱;3=中等;4=强;5=很强。

1.2.8 数据统计分析 结果均采用平均值±标准偏差(mean±SD,n=3)表示。采用SPSS 24.0 对数据进行统计分析,进行ANOVA方差分析,LSD法与Ducan 法进行多重比较,所有显著性均在p≤0.05的水平下检验,未标注显著性代表同组间比较不显著。

2 结果与讨论

2.1 生物学指数分析

8‰低盐度海水暂养对中华绒螯蟹成活率、体重、采肉率及采黄率的影响见表2。经过为期三周的暂养后,样品蟹的成活率下降,活蟹的活力降低,很难继续维持之后的暂养实验。与海水组相比,淡水组的蟹在两周时已经开始有正常死亡的现象出现,证明在8‰低盐度海水中处于饥饿状态下的中华绒螯蟹能够维持更高的存活率。海水组采肉率前两周的变化不明显,第三周下降显著(p≤0.05),淡水组在两周时显著下降,三周时下降更为显著,但两组之间差异不显著。采黄率没有显著变化,可能是因为暂养期间肝胰腺的消耗并促进卵巢的发育[8]。第三周过后,海水组成活率也出现下降,体重显著降低,采肉率及采黄率均有下降,采肉率下降尤其明显,因此商品蟹不适宜更长时间的暂养。成蟹生长在淡水中,当水体环境中存在盐度时会进行渗透压调节以适应环境,如糖原和蛋白质的降解等[6]。

表2 8‰低盐度海水暂养对中华绒螯蟹雌蟹生物学指数的影响Table 2 Effect of temporary culture in 8‰ low salinity seawater on the biological index of Chinese mitten crab

2.2 基本化学组成分析

8‰低盐度海水暂养对中华绒螯蟹肌肉基本化学组成见表3。暂养过程中淡水组水分含量呈下降趋势,海水组水分含量与淡水组变化趋势相反,水分含量出现明显上升,第一周上升较多,二三周后稍有下降但仍比开始含量要高,可能是由于海水组暂养环境中盐度与生长环境的差异造成的渗透压改变而导致的,这也是导致淡水组蟹体重变化不明显的主要原因。中华绒螯蟹肌肉中脂肪含量较少,在暂养过程中淡水组肌肉中脂肪含量低于海水组,盐度的改变使得中华绒螯蟹肌肉中的脂肪消耗增大。淡水组与海水组中蛋白含量较暂养开始均有明显上升,相比海水组,淡水组蛋白质含量在整个暂养过程中一直呈上升趋势,且变化显著。海水组水体环境中的无机盐离子含量较高,可能是导致其灰分高于淡水组的主要原因。总之,8‰低盐度海水暂养通过影响中华绒螯蟹的渗透压调节,进而影响到其自身生长、新陈代谢等能力,基本化学组成也随之改变。

表3 8‰低盐度海水暂养对中华绒螯蟹肌肉基本化学组成的影响Table 3 Effect of temporary culture in 8‰ low salinity seawater on the proximate composition of Chinese mitten crab muscle

2.3 呈味核苷酸和游离氨基酸的组成及含量分析

呈味核苷酸是水产品中重要的呈味成分和助味成分。不同水体暂养中华绒螯蟹雌蟹的呈味核苷酸含量见表4,其中AMP含量最高是因为甲壳纲动物体肉AMP脱氨酶活性较低,导致AMP累积[13]。由于实验采样是蟹死后立即采样,所以其呈味核苷酸差异更接近于活体体内累积。淡水组呈味核苷酸的总量在暂养一周后减少,而海水组有所增加,两组蟹之间结果相反可能是由于海水组适应新环境,而使得能量消耗增加造成的。之后两周核苷酸总量有所减少,但淡水组第三周下降明显,核苷酸总量下降可能是造成第三周活性降低,成活率低于海水组的原因之一。AMP,GMP,IMP三种呈味核苷酸在暂养期间变化与总量变化大致相同。

表4 8‰低盐度海水暂养的中华绒螯蟹雌蟹肌肉呈味核苷酸及游离氨基酸的组成(mg/100 g)Table 4 Effect of temporary culture in 8‰ low salinity seawater on free nucleotide and free amino acid content of female Chinese mitten crab muscle(mg/100 g)

游离氨基酸是甲壳类动物食品中最重要的呈味物质之一,其含量较高,阈值较低,并且与其他呈味物质之间有较强烈的交互相乘作用[14]。中华绒螯蟹的肌肉是主要的蛋白质储存库,因此游离氨基酸含量较高。本实验共检测出16种游离氨基酸,见表4。随着暂养时间的延长,总游离氨基酸含量增加,变化趋势都为暂养一周后上升,第二周下降,第三周后上升,变化明显;海水组与淡水组蟹之间前两周差异比较不明显,第三周后海水组显著高于淡水组。总游离氨基酸含量的前两周变化可能是由于经过长期饥饿状态,能量物质消耗由直接供能物质到脂肪以及蛋白质的分解[10]的变化而影响游离氨基酸增加以及减少的,第三周的显著增加可能是机体体能到达极限迅速消亡造成的结果。鲜味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸含量同组别淡水组皆低于海水组,甜味氨基酸的含量变化趋势与总氨基酸含量变化趋势相同,鲜味氨基酸含量在暂养过程中一直增加,苦味氨基酸含量变化不明显。肌肉中丙氨酸,甘氨酸,精氨酸,脯氨酸四种游离氨基酸占主要部分。有研究表明调节渗透压起主要作用的游离氨基酸包括脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸以及牛磺酸[15-16],可能是造成两组间甘氨酸、丙氨酸以及脯氨酸之间差异的主要原因。谷氨酸是多种氨基酸进入能量代谢循环的中间产物,可能是造成谷氨酸含量升高的主要原因。

对呈味氨基酸组成比例(见图1)分析可知,UFA与SFA在肌肉中占主要部分,超过总量的60%。海水组与淡水组中的UFA变化差异最大,与未暂养蟹样相比所占比例均有明显的增加趋势。

图1 8‰低盐度海水暂养的 中华绒螯蟹雌蟹肌肉游离氨基酸的组成(%)Fig.1 Effect of temporary culture in low salinity seawater on amino acid content of female Chinese mitten crab muscle

海水组SFA在第一周过后占比最高,应该是因为在低浓度盐水中,渗透压的变化引起其自身调节,使得与调节渗透压有关的氨基酸含量上升,尤其是脯氨酸、甘氨酸两种呈甜味氨基酸的增加。UFA与SFA含量增加,使得前两周暂养过程中在含量上变化差异不大的BFA在比例上显示出与未暂养时样品相比明显降低。鲜甜味游离氨基酸比例的升高可能在一定程度上改善蟹的滋味品质。

2.4 滋味强度值(TAV)及味精当量(EUC)

对食品中单一组分滋味强度的判定与其对整体风味贡献评价的探寻时,经常应用TAV值作为最为经典和客观的方法[17-19]。本实验对于检测出所有呈味成分TAV进行评价并筛选得到的滋味活性物质,见表5。筛选结果得到滋味活性物质共八种,丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸对于滋味贡献较大。大部分呈鲜呈甜味氨基酸都表现呈味,呈苦味氨基酸只有缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸超过阈值,其中精氨酸虽为苦味氨基酸,但大量实验证明其在水产品整体滋味中贡献巨大,是正相关表现的[20]。谷氨酸经过暂养后有明显增加,可能是使得感官评价中鲜味强度增加的原因之一。呈甜味的甘氨酸、精氨酸是调控渗透压的重要游离氨基酸,相比起淡水组,海水组都有明显的升高,其余苦味氨基酸在经过两周内的暂养过程都有明显降低,但第三周随着蛋白质消耗增加,游离氨基酸总量升高,其TAV值都有所增加。

表5 8‰低盐度海水暂养的中华绒螯蟹雌蟹肌肉TAV值的影响Table 5 Effect of temporary raised in 8‰ low salinity seawater on amino acid TAV of female Chinese Mitten Crab muscle

呈味核苷酸单独计算其TAV值并不高,仅有AMP超过阈值,但随着暂养时间增加能耗增大,使得其低于阈值,从单一滋味评价并不能看出其对整体滋味的贡献。呈味核苷酸对于鲜味、甜味氨基酸有增鲜的作用。EUC表示鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸等)与呈味核苷酸(包括IMP、GMP 和AMP 等)之间协同作用所产生的鲜味强度相当于多少浓度的谷氨酸钠(monosodium glutamate,MSG)所产生的鲜味强度[21]。最早是由Yamaguchi提出的,得到了充分的认可并广泛应用与鲜味强度的评价当中。8‰低盐度海水暂养的中华绒螯蟹雌蟹肌肉EUC值见图2,随着暂养时间的增长其EUC值增加。暂养一周后海水组鲜味增加高于淡水组,并且二三周都有明显的增加,淡水组后两周较第一周有大幅增加,但之间没有太大变化。

图2 8‰低盐度海水暂养的 中华绒螯蟹雌蟹肌肉EUC值(g MSG/100 g)Fig.2 Effect of temporary culture in 8‰ low salinity seawater on EUC of female Chinese mitten crab muscle(g MSG/100 g) 注:图中标注E代表海水组,C代表淡水组。

2.5 感官评价分析

8‰低盐度海水暂养的中华绒螯蟹雌蟹肌肉感官评价雷达图,见图3。暂养过程中中华绒螯蟹肌肉中鲜味和甜味是差异最大的两个滋味,但随着暂养时长的增加,余味加重使得感官员对其喜好度有所减少。但对于咸味和苦味来说变化不显著。鲜味与甜味是中华绒螯蟹的重要滋味感官品质[14],经过暂养后的肌肉的鲜味与甜味增加,相比未暂养过的蟹,鲜味更加突出,相对于淡水组鲜味、甜味的最强点出现在第二周与第一周,海水组出现在第二周。虽然感官评定的结果表明有一些滋味的味道强度变化,但由于感官者个人主观性以及味道强度无法客观定量,但是可以在一定程度上表示鲜甜味氨基酸增加以及EUC值变化的结果。

图3 8‰低盐度海水暂养的 中华绒螯蟹雌蟹肌肉感官评价雷达图Fig.3 Taste sensory evaluation radar map of female Chinese mitten crab muscle under 8‰ low salinity during temporary culture 注:0～3代表暂养时间(单位:周)

3 结论

淡水组中华绒螯蟹在暂养两周后开始出现死亡,三周后两组均有出现死亡现象,并且体重下降明显,采肉率降低,暂养不能持续进行。两组雌蟹肌肉中的蛋白含量上升,淡水组在暂养后中华绒螯蟹的体重及可食部分逐渐降低,8‰低盐度海水先刺激雌蟹水分增加,体重增加,第一周过后,体重下降,水分下降。海水组暂养两周使得可食部分均有显著增加,并且刺激其性腺的发育,采黄率升高。经过1到2周的暂养可以提高肌肉鲜味以及甜味,肌肉中丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸四种游离氨基酸占主要部分,甜味氨基酸占有50%以上,鲜味氨基酸比例升高。EUC值的结果表明,海水组鲜味在暂养过程中逐步升高,淡水组第二周高于海水组。感官评价的结果表明经8‰低盐度海水暂养的雌蟹在第二周过后评价最佳。综上,8‰低盐度海水暂养对中华绒螯蟹雌蟹肌肉滋味有改善的作用。

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