乙酸肉桂酯在固定化脂肪酶反应器中的合成

周美娟，张莹，丛方地,,通信作者，张树林，刘黎瑶，罗巍



乙酸肉桂酯在固定化脂肪酶反应器中的合成

周美娟1，张莹1，丛方地1,2,通信作者，张树林2，刘黎瑶1，罗巍1

（1. 天津农学院 基础科学学院，天津 300384；2. 天津市水产生态与养殖重点实验室，天津 300384）

为提高乙酸肉桂酯的酶促合成效果，在柱形玻璃瓶中，将脂肪酶（lipase）固定在脱脂棉上，形成一种简易的生物反应器，用于催化肉桂醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应。结果表明：在37℃、160 r/min条件下，12 h后，反应器中的固定化酶可使92％的底物转化，而酶粉仅能转化35％的底物。在静置条件下，分别在37、25和4 ℃保温12 h，底物转化率分别为88%、84%和44％。在每次6 h的重复催化试验中，固定化酶和酶粉转化底物能力每小时降低率分别为0.3%、0.5%。可见，反应器中的固定化酶相对于酶粉，其催化活性和非水稳定性明显提高，即使在室温和静置条件下，这种固定化酶反应器也表现出较高的催化活性，是一种低碳、高效的固定化酶反应器。

乙酸肉桂酯；脂肪酶；脱脂棉；酶活性；酶稳定性

食用香精是食品工业不可或缺的成分，大多食用香精的分子是酯类化合物，广泛存在于自然界中，具有浓郁的花香、果香[1]。乙酸肉桂酯是我国规定可以使用的一种食用香精，具有甜香、花香，并伴有浓郁的又辣又甜的菠萝味道[2]。其制备方法有多种，起初只能从天然植物中提取，但提取量极少且纯度较低，不能满足市场需要[3]。而后，采用化学法合成纯度相对较高的乙酸肉桂酯，但常伴有副反应发生，且后续分离提纯工艺繁琐，对设备要求高，易造成环境污染[4]。目前，工业上更多地使用微生物脂肪酶来催化合成重要的酯类化合物，特别是非水相中的酶促合成酯类的反应[5-6]。非水酶促合成方法，不仅反应条件温和、效率高、专一性强，而且不易造成环境污染，可极大程度地克服化学合成法的缺点[7]。但酶催化过程中的酶活性和稳定性，仍然需要进一步的提高。本文基于脂肪酶的界面活化机制，选用假单胞菌脂肪酶（lipase，PCL）为生物催化剂，通过物理吸附，在柱形玻璃瓶中将PCL固定在脱脂棉上，形成一种简易的固定化酶生物反应器，用于催化肉桂醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应。相对于脂肪酶粉，这种生物反应器表现出较好的非水催化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

假单胞菌脂肪酶（PCL，33 U/mg）购于杭州创科生物科技有限公司，肉桂醇为化学纯试剂（≥98%），乙酸乙烯酯、石油醚和正己烷皆为分析纯，医用脱脂棉购于市场。固定化操作和催化反应在摇床（HZQ-X恒温摇床，哈尔滨）中进行。反应动力学分析使用气相色谱法（GC，仪盟A90，上海），色谱仪配有氢火焰检测器和毛细管柱（SE-30，30 m×0.32 mm×0.33 µm）。酶构象分析使用红外光谱分析仪（I R Affinity-1，苏州）。

1.2 脱脂棉预处理

取约5 g脱脂棉置于100 mL的干净烧杯中，加入无水乙醇将脱脂棉完全浸没，在室温下放置1～2 d后，将脱脂棉取出并置于干净的烧杯中，用纱布将烧杯口封住，自然晾干，晾干后用镊子将其撕成蓬松状备用。

1.3 PCL的固定化

参考以前的研究[8-9]，PCL 用量为10 mg。选用10 mL 的柱形玻璃瓶作为固定化容器。加入10 mg PCL 酶粉和0.2 mL 的蒸馏水，待酶粉完全溶解后，加入脱脂棉，使脱脂棉充分吸附酶液，再将柱型玻璃瓶固定在摇床中，敞口，在37 ℃和160 r/min下保持6 h，恰好可以使酶吸附在脱脂棉上，得到脱脂棉固定化酶PCL，简称脱脂棉固定化PCL，它和柱形瓶一起形成一个简易的脱脂棉固定化酶反应器。

1.4 酶促转酯反应

在脱脂棉固定化PCL酶反应器中，加入肉桂醇（1.34 g，10 mol）与乙酸乙烯酯（2 mL，21.6 mol），盖上盖子，封口膜密封，在37 ℃、160 r/min的条件下催化反应。PCL酶粉催化反应时，在10 mL柱型玻璃瓶中，加入10 mg酶粉，其他反应条件相同。如果重复使用酶催化反应，可以将反应液倒出，用少许正己烷清洗，后加入新的反应液，在上述反应条件下反应。

1.5 酶动力学分析

定期量取2 μL反应液，用1 mL正己烷稀释，0.25 μm 滤膜过滤，进行GC 分析。色谱条件为：氮气（0.4 MPa，分流比1∶1），130 ℃，保留1 min；20 ℃/min，210 ℃，保留5 min；60 ℃/min，280 ℃，保留2 min。进样和检测温度分别为280 ℃和 300 ℃。通过比较肉桂醇和乙酸肉桂酯的峰面积得出。底物的摩尔转化率[10]，肉桂醇和乙酸肉桂酯的保留时间分别为3.8 min、4.7 min。

1.6 红外光谱分析

采用溴化钾压片法[11]，PCL与溴化钾混合压片，若是使用过的PCL，用正己烷洗涤，待溶剂挥发后，再与溴化钾混合压片，用于红外分析。如果是固定化酶，先将固定有PCL的棉纤维在溴化钾中研磨，后将棉纤维取出，再做压片。红外光谱使用IRsolution 1.50SU1软件解卷积，用Origin 8.5分析酰胺Ⅰ带，采用二次导数自动寻峰和Gaussian曲线拟合。

2 结果与分析

2.1 最适脱脂棉用量

为确定脱脂棉的最佳用量，PCL为10 mg时，分别称取不同质量的脱脂棉，在10 mL柱型玻璃瓶中进行PCL的固定化，用于催化肉桂醇与乙酸乙烯酯的转酯反应，通过GC分析，得出酶促转酯反应的动力学，如图1。结果发现，脱脂棉用量为15 mg时，酶促催化转酯反应效果相对较好。脱脂棉用量不足时，转化底物的能力相对较低，原因是没有足量的棉纤维充分分散酶蛋白。而脱脂棉用量过多，棉纤维会阻碍底物分子的运动，导致底物分子不能充分与酶蛋白接触。所以，在后续试验中，选用15 mg脱脂棉进行固定化并进行相应的研究。制备的脱脂棉固定化酶PCL与柱形玻璃瓶一起形成了一种简易的固定化酶生物反应器，如图2。

图1 不同脱脂棉用量下的酶促反应动力学

图 2 固定化酶PCL生物反应器示意图

注：1：瓶壁；2：吸附在瓶壁上的少量PCL；3：脱脂棉固定化PCL（表面吸附PCL的脱脂棉）；4：棉纤维间间隙；5：摇动条件下流动的反应液

2.2 固定化酶与酶粉的活性比较

与酶粉相比较，脱脂棉固定化PCL的催化动力学曲线明显较高，如图 3。催化反应初期，2 h后，固定化酶和酶粉催化的转酯反应的转化率分别为40.1%和15.2%，前者是后者的2.6倍。12 h后，转化率分别为92.0%和35.3%，前者仍然是后者的2.6倍。表明固定化PCL酶反应器的催化活性不仅显著高于PCL酶粉，而且随着时间的延长，固定化酶反应器的活性没有明显降低，说明反应器中的脱脂棉固定化酶在有机相中是比较稳定的[12 ]。

图 3 脱脂棉固定化PCL酶与PCL酶粉在不同条件下的动力学

注：◆脱脂棉固定化PCL，37 ℃、160 r/min；◇脱脂棉固定化PCL，37 ℃、0 r/min；▲脱脂棉固定化PCL，25 ℃、0 r/min；□脱脂棉固定化PCL，4 ℃、0 r/min；■PCL酶粉，37 ℃、160 r/min

2.3 静置和低温下酶反应器活性

加入反应液的脱脂棉固定化PCL反应器，在37、25、4 ℃下，保持静置，仍然保持优良的催化活性（图3）。在37 ℃，静置条件与160 r/min条件相比，静置时的脱脂棉固定化PCL的催化活性几乎没有明显的降低，这可能是因为脱脂棉纤细的纤维状结构使之有较大的比表面积，非常有利于PCL酶蛋白的分散，有效地降低了酶的扩散限制。加之棉纤维的柔韧性，有利于与液相充分接触。因此，在静置时，这种固定化PCL依然有很高的催化活性。在25 ℃室温静置条件下，这种反应器的活性依然比较理想。反应12 h后反应液的GC显示，静置条件下，在温度为37 ℃和25 ℃时，反应器中底物已经绝大部分被转化，转化率分别为88%和84%，与37 ℃和160 r/min条件下转化率（92%）相比，静置条件没有对转化率产生较大影响，而且都明显高于37 ℃和160 r/min条件下酶粉催化反应的转化率（35%）。

如图4显示，催化12 h后，37（25）℃和静置条件，与37 ℃和160 r/min相比较，固定化酶依然能将绝大部分肉桂醇转化为乙酸肉桂酯。即使在4 ℃，静置的这种反应器的催化活性仍高于酶粉在37 ℃、160 r/min条件的活性（图3）。可见，脱脂棉固定化PCL酶反应器是一种低碳生物反应器，有较大的潜在应用价值。

图 4 酶促转酯反应12 h后反应液的色谱图

注：1：肉桂醇；2：乙酸肉桂酯；A：脱脂棉固定化PCL，37 ℃、160 r/min；B：脱脂棉固定化PCL，37 ℃、0 r/min；C：脱脂棉固定化PCL，25 ℃、0 r/min；D：脱脂棉固定化PCL，4 ℃、0 r/min

2.4 固定化酶非水稳定性

脱脂棉固定化PCL和PCL酶粉的重复催化反应试验表明，再次使用时，它们的催化活性有所降低，见表 1。在重复使用3次，每次6 h，共18 h，比较反应的转化率降低值，脱脂棉固定化PCL催化的反应中，转化率平均每小时降低0.3%，PCL酶粉催化反应中，转化率平均每小时降低0.5%。说明固定化酶的非水稳定性较好。

表1 脱脂棉固定化PCL和PCL酶粉转化底物的能力（使用3次，每次6 h）

注：n：转化率；：每小时转化降低率；=（13）/12

通过对PCL酶粉和脱脂棉固定化PCL的红外光谱的去卷积处理，再用origin 8.5软件进行二次求导寻峰，并用Gaussian方程曲线拟合，得出如图5所示的拟合曲线。从图5可以看出，代表蛋白质二级结构的酰胺I带[5,13-15]在有机体系中有明显的变化。

图 5 PCL酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）Gaussian拟合曲线

注：A：PCL酶粉使用前酰胺I带拟合曲线；B：PCL酶粉使用18 h后酰胺I带拟合曲线；C：固定化酶使用前酰胺I带拟合曲线；D：固定化酶使用18 h后酰胺I带拟合曲线

在有机反应体系中使用18 h后，PCL酶粉的-螺旋含量变化较小，-折叠含量明显降低，降低10.8%，转角含量也降低约3.3%，无规卷曲含量增加了约13.5%；脱脂棉固定化PCL在使用前，相对于酶粉构象发生了明显的变化，-螺旋和-折叠的总量有所增加，在使用18 h后，虽然无规卷曲含量增加了6.9%，转角含量降低了5.3%，-折叠含量降低了19.1%，但-螺旋含量增加了17.5%，（表 2）。上述构象的变化，说明PCL酶粉的构象不够稳定，而脱脂棉固定化PCL的构象，在使用中虽然有较大变化，但有序构象却保持了较高的含量，说明脱脂棉有助于维持脂肪酶的有序结构，增强酶抗有机溶剂的变性作用。因而，在重复使用过程中，固定化酶的活性降低较少，表现出较好的非水催化活性和稳定性。

表2 有机体系对脱脂棉固定化PCL构象的影响

注：表中小写字母a表示平行式折叠（反平行式折叠）

3 结论

研究证明，相对于酶粉，脱脂棉固定化PCL酶反应器非水催化活性有明显提高。说明脱脂棉是一种较为理想的固定化载体，它如同水/油界面上的水分子，可以在非水条件下有效地稳定酶蛋白，使其保持优势蛋白构象，表现出优良的非水催化活性和较好的稳定性。静置条件下，脱脂棉固定化PCL酶反应器仍然保持优良的催化活性，说明棉纤维的结构非常有利于降低酶的扩散限制，这种酶反应器具有低碳条件催化特性。固定化酶的重复应用表明，相对于酶粉，其非水稳定性有所增加。红外光谱酰胺Ⅰ带的分析显示，脱脂棉固定化脂肪酶的二级结构相对于酶粉，其有序性较高，在有机体系中使用18 h后，虽然二级结构有较大改变，但二级结构的有序性依然较高，说明脱脂棉固定化酶PCL有较大的非水稳定性。

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责任编辑：宗淑萍

Synthesis of cinnamyl acetate in an immobilized-lipase bioreactor

ZHOU Mei-juan1, ZHANG Ying1, CONG Fang-diCorresponding Author, ZHANG Shu-lin2,LIU Li-yao1, LUO Wei1

（1. College of Basic Sciences, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Key Lab of Aqua-ecology and Aquaculture, Tianjin 300384, China）

To improve the synthetic effect of cinnamyl acetate,lipase was immobilized on cotton fibers in a column glass bottle to form a facile bioreactor and used to catalyze transesterification between cinnamyl alcohol and vinyl acetate. The results were that the bioreactor could transform 92% of substrate after 12 h at 37 ℃ and 160 r/min while native lipase only gave a conversion of 35% under the same reaction conditions. Even at static state, the bioreactor brought high conversions, which were 88%, 84% and 44% after 12 h at 37, 25 and 4 ℃, respectively. In repeated 6 h catalysis, the immobilized and native lipases exhibited that the decrease rates in ability of transforming substrate were 0.3% and 0.5% per hour. It showed that the immobilized lipase in bioreactor behaved activity and stability higher than native lipase in the non-aqueous phase, which was also so at static state. This meant that it was a type of effectively low-carbon immobilized lipase bioreactor.

cinnamyl acetate; lipase; absorbent cotton; enzyme activity; enzyme stability

TS 201.3

A

1008-5394（2018）01-0064-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.01.014

2017-05-31

国家级大学生创新创业训练计划项目（201410061136）；天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金项目（TJAE201502）；国家自然科学基金项目（31170442）

周美娟（1993-），女，本科在读，从事非水相酶催化方面的研究。E-mail：1138816897@qq.com。

丛方地（1968-），男，教授，博士，从事生物催化方面的研究。E-mail：congfangdi@163.com。