正交试验法优选肉桂油的水蒸气蒸馏法提取工艺

周雨晴，梁迪，杜沛霖

(1.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023；2.广西中医药大学附属国际壮医医院，南宁 530201；3.广西中医药大学，南宁 530200)

肉桂是樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥树皮[1]，既是中药，又能作为香料和防腐剂使用，是重要的药食同源品种[2]。肉桂油为肉桂的挥发油，主要活性成分肉桂醛具有抗真菌[3]、抗细菌作用[4,5]，肉桂醛处理后能保持水果、海鲜等的新鲜度[6,7]，延长存储时间，是良好的天然防腐剂[8]。肉桂醛沸点为253 ℃，比其他香料成分沸点高，香味更持久[9]，是制作道口烧鸡、卤料、火锅底料的重要风味贡献物质[10-12]。用得油率这个单一指标无法准确评价肉桂油的质量，因此，本试验以得油率和肉桂醛含量为指标，用正交试验法优化肉桂油的水蒸气蒸馏法提取工艺。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

肉桂(批号20150901)：北京同仁堂健康药业(福州)有限公司；肉桂醛对照品(批号110710-201619)：中国食品药品检定研究院；甲醇(分析纯，批号20150604)：国药集团化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯)；水(超纯水)。

1.2 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；DFY-800型摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司；KQ5200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；98-1-B型电子调温电热套 天津市泰斯特仪器有限公司；BS224S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；TGL-16G型离心机 上海安亭科学仪器厂。

2 试验方法与结果

2.1 肉桂醛测定方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈∶水为35∶65(V/V)，检测波长为290 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，洗脱时间为等度洗脱30 min，柱温为35 ℃。

2.1.2 对照品溶液的制备

称取适量肉桂醛对照品，精密称定，加入甲醇配制成浓度为0.328 mg/mL的肉桂醛对照品储备液。精密移取肉桂醛对照品储备液1 mL，置于25 mL容量瓶中定容，摇匀，即可得到每1 mL含肉桂醛13.12 μg的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

参照2.3正交试验优选条件提取肉桂油，以5000 r/min离心10 min，吸去上层清水，精密称定后，用甲醇定容至50 mL，作为样品溶液，精密移取0.5 mL样品溶液，用甲醇定容至50 mL，再次精密移取0.5 mL稀释后的样品溶液，用甲醇定容至10 mL，即得供试品溶液。

2.1.4 空白对照溶液的制备

取甲醇适量，经微孔滤膜过滤处理，按2.1.1色谱条件进样测定，记录色谱图。

2.1.5 系统适应性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液各10 μL，按2.1.1色谱条件进行测定，结果见图1。

图1 对照品、供试品、空白对照溶液的HPLC图Fig.1 HPLC diagrams of control sample, test sample and blank control solution

由图1可知，肉桂醛对照品的出峰时间为18 min，而空白对照溶液在此保留时间无吸收峰，说明背景溶液不干扰肉桂醛的含量测定。

2.1.6 方法学考察

2.1.6.1 线性关系考察

取2.1.2项下的肉桂醛对照品溶液适量，分别进样4，6，8，10，12，14 μL。按2.1.1色谱条件测定，结果见表1。以肉桂醛峰面积(A)为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线，见图2。回归方程为：Y=11361.5237X+0.0194414(r2=1.00000)，肉桂醛在0.052～0.182 μg范围内的线性关系良好。

表1 肉桂醛对照品测定结果Table 1 The determination results of cinnamaldehyde reference substance

图2 肉桂醛标准曲线图Fig.2 The standard curve of cinnamaldehyde

2.1.6.2 精密度试验

精密吸取肉桂醛对照品溶液，参照2.1.1色谱条件，进样量为10 μL，测得峰面积的平均值为1516.7，RSD值为0.04%，结果显示本方法精密度良好。

2.1.6.3 重复性试验

取同一批次的肉桂粉末6份，每份60 g，同法制备肉桂油供试液，按2.1.1色谱条件进样，测得峰面积平均值为1699.3，RSD值为1.89%，表明本方法重复性良好。

2.1.6.4 稳定性试验

精密量取肉桂油供试品，分别于0，4，8，12，16，24 h，按2.1.1色谱条件试验，每次进样量为10 μL。计算其RSD值为0.60%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.1.6.5 加样回收试验

取6份已知含量(2.4257%)的肉桂粉末，每份30 g，精密称定后，分别加入与样品中肉桂醛含量相近的对照品溶液，采用优选的最佳方案提取肉桂油后按2.1.3供试品溶液的制备方法处理，并按2.1.1色谱条件测定肉桂醛的含量。计算回收率，得平均回收率为100.91%，RSD值为2.61%，结果见表2。

表2 肉桂醛回收率试验结果Table 2 Results of cinnamaldehyde recovery test

2.2 单因素考察

2.2.1 药材粉碎度的考察

取原药材饮片粉碎过4，10，24，50，65目筛的肉桂粉末各60 g，加入10倍水，分别浸泡30 min，加热回流5 h，并按2.1.3项下方法处理肉桂油样品，计算肉桂油得率，并按2.1.1色谱条件进样测定肉桂醛含量，比较肉桂醛含量和肉桂油得率选出最优粉碎度，结果见图3和图4。

图3 药材粉碎度对肉桂醛含量的影响Fig.3 Effect of crushing degree of medicinal materials on cinnamaldehyde content

图4 药材粉碎度对肉桂油得率的影响Fig.4 Effect of crushing degree of medicinal materials on cinnamon oil yield

由图3和图4可知，药材粉碎度越高，肉桂醛含量和肉桂油得率越低，原因可能是肉桂油是易挥发性物质，肉桂粉碎过细，粉碎时间长，从而导致肉桂油在粉碎过程中流失，因此选择4，10，24目作为正交试验考察水平。

2.2.2 浸泡时间的考察

取24目肉桂粉末5份，每份60 g，加10倍水，分别浸泡0，30，60，90，120 min，加热回流5 h，并按2.1.3项下方法处理肉桂油样品，计算肉桂油得率，并按2.1.1色谱条件进样测定肉桂醛含量，比较肉桂醛含量和肉桂油得率选出最优浸泡时间，结果见图5和图6。

图5 药材浸泡时间对肉桂醛含量的影响Fig.5 Effect of soaking time of medicinal materials on cinnamaldehyde content

图6 药材浸泡时间对肉桂油得率的影响Fig.6 Effect of soaking time of medicinal materials on cinnamon oil yield

由图5和图6可知，药材浸泡时间对肉桂醛含量和肉桂油得率均有一定的影响，浸泡时间越长，肉桂醛含量越高，而肉桂油得率有所下降，因此综合考虑后，选择浸泡30，60，90 min作为正交试验考察水平。

2.2.3 加水量的考察

取24目肉桂粉末5份，每份60 g，分别加4，6，8，10，12倍水浸泡30 min，蒸馏5 h，并按2.1.3项下方法处理肉桂油样品，计算肉桂油得率，并按2.1.1色谱条件进样测定肉桂醛含量，比较肉桂醛含量和肉桂油得率选出最优加水倍数，结果见图7和图8。

图7 药材加水倍数对肉桂醛含量的影响Fig.7 Effect of water addition times of medicinal materials on cinnamaldehyde content

图8 药材加水倍数对肉桂油得率的影响Fig.8 Effect of water addition times of medicinal materials on cinnamon oil yield

由图7和图8可知，加水量过少，药材浸泡不完全且容易粘锅，肉桂醛难以提取完全；而加水量过多，肉桂油易随着蒸馏水挥发，肉桂醛含量和肉桂油得率均有所下降，因此选择加水6，8，10倍作为正交试验考察水平。

2.2.4 蒸馏时间的考察

取24目肉桂粉末5份，每份60 g，加10倍水浸泡30 min，分别加热回流3，4，5，6，7 h，并按2.1.3项下方法处理肉桂油样品，计算肉桂油得率，并按2.1.1色谱条件进样测定肉桂醛含量，比较肉桂醛含量和肉桂油得率选出最优蒸馏时间，试验结果见图9和图10。

图9 药材蒸馏时间对肉桂醛含量的影响Fig.9 Effect of distillation time of medicinal materials on cinnamaldehyde content

图10 药材蒸馏时间对肉桂油得率的影响Fig.10 Effect of distillation time of medicinal materials on cinnamon oil yield

由图9和图10可知，肉桂醛含量和肉桂油得率均随蒸馏时间的增加而呈上升趋势，在蒸馏时间达到6 h后，肉桂醛含量和肉桂油得率有所下降，说明在蒸馏过程中，时间过长，肉桂醛含量会有所损失，因此为节约生产成本，选择蒸馏4，5，6 h作为正交试验考察水平。

2.3 正交试验

参考文献[13-15]，设计水蒸气蒸馏法提取肉桂油的正交试验。选择药材粉碎度(A)、浸泡时间(B)、加水倍数(C)、蒸馏时间(D)为考察因素，每个因素设3个水平进行L9(34)正交试验。

准确称取肉桂粉末9份，每份60 g，按L9(34)正交试验条件提取肉桂油，按2.1.3项下方法处理肉桂油样品，并按2.1.1色谱条件测定肉桂醛含量，试验因素水平设计见表3，正交试验结果见表4，肉桂醛含量方差分析表见表5，肉桂油得率方差分析表见表6。

表3 正交试验因素水平设计Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

表4 L9(34)正交试验结果Table 4 The results of L9(34) orthogonal experiment

表5 肉桂醛含量方差分析表Table 5 The variance analysis of cinnamaldehyde content

表6 肉桂油得率方差分析表Table 6 The variance analysis of cinnamon oil yield

根据正交试验所得结果分别对肉桂醛含量和肉桂油得率进行直观分析和方差分析，由表4直观分析结果可知，影响肉桂油提取工艺的因素顺序为加水倍数(C)>粉碎度(A)>蒸馏时间(D)>浸泡时间(B)，综合考虑肉桂醛含量和肉桂油得率结果发现，肉桂醛含量在浸泡90 min时比浸泡60 min时高一点，但经t检验法计算，两者之间无显著性差异，因而为节约生产成本，选择最优浸泡时间为60 min，确定最佳工艺组合为A2B2C1D3。以R值最小的B因素为误差项进行肉桂醛含量方差分析估算，只有加水倍数对提取结果具有显著性影响，且蒸馏6 h与蒸馏5 h的肉桂油含量差异不大，而对肉桂油得率进行方差分析估算发现除了加水倍数，粉碎度对提取结果也有显著性影响。因此综合考虑工业上的生产，最后确定肉桂油的最佳提取工艺为A2B2C1D2，即药材粉碎度10目，浸泡60 min，加6倍水，蒸馏5 h。

2.4 样品含量测定

按优选的最佳提取方案，进行了3 批验证试验：取10目肉桂粉末3份，过10目筛，浸泡60 min，加6倍水，蒸馏5 h，提取肉桂油，结果见表7。

表7 样品中肉桂醛含量和得油率Table 7 The cinnamaldehyde content and cinnamon oil yield in the samples

由表7可知，肉桂醛含量测定平均值为2.4343%，RSD为1.52%，得油率平均值为3.1282%，表明优选出的组合A2B2C1D2工艺稳定可行。

3 结果与讨论

肉桂醛是易挥发成分，粉碎越细，粉碎时间越长，提取物中含量越小，因此应尽量减少粉碎度，缩短粉碎时间。浸泡可以使肉桂组织细胞膨胀，细胞间隙变大，加速挥发油从药材中渗出，从而利于挥发油的提取。但过长的浸泡时间也会使挥发油从提取溶剂中析出、挥发，造成挥发油的损失。

挥发油提取方法主要有水蒸气蒸馏法、无溶剂微波蒸馏法、超声辅助溶剂萃取法、超临界CO2流体提取法[16]、微波提取法[17,18]、亚临界水萃取法等[19]，本试验采用的水蒸气蒸馏法成本低，绿色环保，可为肉桂油的提取提供一定技术参考。

肉桂醛是肉桂挥发油中发挥药效的重要成分和指标，用得油率这一单一指标评价肉桂挥发油不尽合理，因此，本试验设计加入肉桂醛含量这一指标，综合筛选出最佳的提取工艺：粉碎度10目，浸泡60 min，加6倍水，蒸馏5 h，得油率为3.1282%，肉桂醛含量为2.4343%。