WZM5-EPS菌剂对土壤水肥保持及棉花幼苗生长的影响

王艳梅，任梦楠，金玉，李思琪，黄海东



WZM5-EPS菌剂对土壤水肥保持及棉花幼苗生长的影响

王艳梅，任梦楠，金玉，李思琪，黄海东通信作者

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384）

WZM5是从内蒙古翁牛特沙漠土样中筛选得到的一株胞外多糖合成菌，形态学和16S rDNA序列的分子鉴定结果表明，WZM5属属，与的同源性最高，为98.5%。菌株WZM5发酵液为高黏度的触变性流体，具有良好的假塑性，将其制成WZM5-EPS菌剂，分别喷施在不同质地土壤表面，具有明显的保水保肥效果，黏土、壤土和砂土的持水能力分别比对照增加了49.2%、83.9%和42.3%，砂土中铵态氮、磷酸根离子和钾离子的淋溶损失分别减少了36.1%、96.5%和36.3%。盆栽试验表明，WZM5-EPS菌剂不会影响棉花种子的萌发和幼苗出土，可促进棉花幼苗的生长。

菌剂；属；保水；保肥

在我国北方干旱半干旱地区，由于气候变化和不合理的土地开发造成土壤退化，土壤水肥气热调节功能降低，严重影响农作物的生长和发育[1-2]。土壤微生物在土壤形成及发育过程中起着极其重要的作用，其中某些微生物能够合成胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS），这些具有极强适应性和生存能力的黏性微生物，在土壤形成的早期发育阶段起到拓殖作用，对土壤的结构和肥力恢复起到重要作用[3-5]。研究表明，土壤微生物可以将非结晶黏胶状的有机物黏结在一起，进一步黏结矿质土粒，形成稳定的团聚体，增强土壤的保水保肥能力[6-7]。目前，荒漠环境中胞外多糖合成微生物的分离和菌剂研发大都集中在藻类，对细菌的研究较少[8-10]。笔者从内蒙古翁牛特沙漠土样中筛选得到一株合成胞外多糖的细菌WZM5，利用形态学和16S rDNA测序进行分类鉴定，并将其制成菌剂，研究WZM5-EPS菌剂对不同质地土壤的水肥保持作用，以及对棉花幼苗生长的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌种WZM5从内蒙古翁牛特沙漠土样中筛选得到，由本实验室保藏。供试土壤有3种，砂土采自天津市武清区王庆坨，壤土购自天津市曹庄花卉市场，黏土采自天津农学院试验田。窄分布葡聚糖分子量标准品购自中国计量科学研究院；DNA提取、PCR扩增等试剂购自北京天根公司；硝酸铵、磷酸氢二氨、硫酸钾等均为分析纯试剂。DP125B棉花种子由天津农学院农学实验室提供。

1.2 培养基

筛选培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨3 g/L，牛肉膏1 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 0.5 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.0～7.5。

发酵培养基：蔗糖30 g/L，亚硝酸钠1.0 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.4 g/L，碳酸钙1.0 g/L。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的分离纯化

称取10 g内蒙古翁牛特沙漠土样置于装有100 mL无菌水的三角瓶中，充分溶解混匀。将摇匀的土样溶液静置，取样梯度稀释，涂布平板培养基，在30 ℃恒温条件下进行培养。挑选质地黏稠的菌种，摇瓶发酵培养，筛选出发酵黏度较高的菌株。

1.3.2 WZM5的形态学观察

将筛选到的WZM5菌种，划线接种到固体平板培养基上，30 ℃培养72 h，观察菌落形态，并取样染色，在光学显微镜下观察细胞形态[11-12]。

1.3.3 WZM5的分子分类鉴定

提取WZM5基因组DNA，用细菌16S rDNA通用引物27F（5'-GAGAGTTTGATCCTGGCT CAG -3'）和1542R（5'-TACGGCTACCTTGTTAC GACTT-3'）扩增目的基因片断，琼脂糖凝胶电泳检测。采用DNA产物纯化试剂盒将得到的PCR产物纯化，然后与pGM-T载体连接，转化至TOP10感受态细胞中，在含有 IPTG和X-Gal的LB平板上过夜培养，挑取白色单菌落验证，送北京奥科鼎盛公司测序。将得到的16S rDNA序列结果与GenBank中的核酸数据进行BLAST比对，得到与其同源性最高的序列，采用软件ClustalX1.8对所获得的核苷酸序列进行分析，得到序列之间的相似值。利用软件 MEGA2.0计算出序列的系统进化距离，采用邻位相连法构建系统进化树[13]。

1.3.4 WZM5-EPS菌剂的流变学特性测定

将WZM5发酵液稀释至6 r/min下、黏度为500 mPa·s的WZM5-EPS菌剂（108CFU/mL），利用Brookfield R/S Plus旋转流变仪，在20 ℃条件下，测定其剪切速率在0～200～0 r/min范围内的流变学特性。

1.3.5 WZM5-EPS菌剂的保水保肥效果研究

称取1 000 g自然风干的砂土、壤土和黏土，分别加入300 g水和EPS菌剂，室温下自然蒸发，定时称重。水分完全蒸发后，各处理再加入200 g水，称重，观察并比较其水分蒸发情况。

准确称取1 000 g自然风干的砂土、壤土、黏土，置于底部带孔花盆中，取硝酸铵、磷酸氢二铵、硫酸钾溶于水及WZM5-EPS菌剂中，将300 g样液加入土壤中，氮、磷、钾的施用量均为每盆600 mg，每个处理设3个重复。室温条件下放置，7 d后加250 mL水淋溶1次，收集淋溶液，用BioProfile300A多参数生化分析仪（NOVA公司）检测土壤淋出液中的铵态氮、磷酸根离子、钾离子含量。

1.3.6 WZM5-EPS菌剂对棉花幼苗生长的影响

土壤为砂土、壤土和黏土，采用盆栽的方法，每盆1 000 g土壤中种植5颗棉花种子，加入40 g菌剂，每个重复3盆，置于25 ℃光照培养箱中，设置12 h光照，12 h黑暗。收获幼苗后，分别测定幼苗地上部分的鲜重、干重、株高，地下部分根的鲜重、干重和根长等指标。

2 结果与分析

2.1 菌株WZM5的形态特征

WZM5的形态特征如图1和图2所示，WZM5为革兰氏染色阴性细菌，杆状，细胞大小为（0.6～0.8）μm×（1.3～2.1）μm，在筛选平板培养基上，初期形成乳白色不透明的菌落、扁平状、边缘整齐、表面湿润、质地黏稠、易挑起。培养72 h后，菌落为乳黄色，边缘翘起形成褶皱，菌落直径为6～11 mm。

图1 WZM5的菌落形态

图2 WZM5的细胞形态

2.2 菌株WZM5的分子分类鉴定

扩增获得WZM5的16S rDNA片段，经DNA测序，碱基序列长度为1 373 bp，在GenBank中的序列登记号为KY458551.1。将该序列与GenBank数据库中的16S rDNA的序列进行BLAST比对，发现菌株WZM5与sp同源性较高，用邻位相连法构建系统进化树（图3），可以看出菌株WZM5与划分在同一簇内，且与该菌的同源性最高，达到98.5％。结合形态学指标，可以确定WZM5属属。

图3 菌株WZM5的16S rDNA序列系统进化树

2.3 WZM5-EPS菌剂的流变学特性

菌株WZM5在30 ℃、180 r/min摇床振荡培养2 d后，发酵液呈高黏度流体，以剪切速率6 r/min、黏度500 mPa·s为标准稀释发酵液，制成WZM5-EPS菌剂。为测试菌剂的流变学特性，设计0～200～0 r/min的剪切速率变化程序，结果如图4所示。图4表明，随着剪切速率的增高，WZM5-EPS菌剂的黏度下降，具有良好的假塑性；在剪切速率降低的过程中，菌剂的黏度逐渐恢复，以最高剪切速率200 r/min（120 s）为分界线，左右两边不对称，表明菌剂黏度恢复时有滞后性，因此WZM5-EPS菌剂属于触变性流体。

图4 WZM5-EPS菌剂的流变学特征

2.4 WZM5-EPS菌剂对土壤水分含量的影响

WZM5-EPS菌剂对3种土质水分含量的影响见图5。由图5可以看出，WZM5-EPS菌剂在3种土质中保水效果均优于对照组。保水试验12 d，砂土、壤土和黏土中的土壤含水率与对照相比分别增加了42.3%、83.9%、49.2%，说明菌剂对壤土的保水效果最好。

图5 菌剂对土壤含水量的影响

2.5 WZM5-EPS菌剂的保肥效果

通过淋溶模拟降雨试验，分析氮、磷、钾从土壤中的淋失情况。由图6可以看出，铵态氮在土壤中最容易流失，磷肥施入土壤后被土壤吸附较多，这与文献报道的研究结果相同[14-15]。施用WZM5-EPS菌剂后，黏土、壤土、砂土中铵态氮淋溶损失分别减少了66.7%、54.9%和36.1%；磷肥在3种土壤中淋溶损失分别减少了87.7%、28.4%和96.5%；钾肥在3种土壤中淋溶损失分别减少了50.0%、31.3%和36.3%。说明WZM5-EPS菌剂在土壤表面形成的结皮，可以加强土壤对肥料的吸附和保持，减少降雨后肥料进入液相，从而减少肥料元素的流失。

图6 WZM5-EPS菌剂的保肥效果

2.6 WZM5-EPS菌剂对棉花幼苗生长的影响

经菌剂处理的盆栽棉花种子在5 d后，与对照同时出土，说明施用WZM5-EPS菌剂不会抑制棉花种子的萌发，在土壤表面形成的生物结皮也不会阻碍幼苗的出土。棉花幼苗生长至第32 天，观察到菌剂处理组的棉花幼苗株高和叶片面积明显高于对照组，结果如图7所示。

图7 WZM5-EPS菌剂对棉花幼苗生长的影响

在黏土、壤土和砂土中，菌剂处理的棉花株高分别比对照增加了34.5%、29.8%和21.8%；棉花幼苗的地上部干重分别比对照增加了98.1%、9.8%和22.0%；在黏土中，菌剂处理的棉花根干重增加了52.4%，在壤土和砂土中，菌剂处理的棉花根干重与对照组没有差别。有文献报道，由于保水剂强烈的吸水能力，在土壤中施用过量的化学保水剂，会产生与作物根系“争水”的现象，不利于作物的生长[16-17]。WZM5-EPS菌剂在保水能力较强的黏土中，能给棉花根系提供更多水分，有利于根系生长，但在保水效果较差的壤土和砂土中，菌剂虽然可提高棉花株高和地上部分干重，但对根系生长的影响有限，说明在施用WZM5- EPS菌剂时，所适用的土壤类型、作物种类和施用方式等仍需进一步深入研究。

3 结论

从内蒙古翁牛特沙漠土样中分离到一株合成EPS的细菌WZM5，分类鉴定结果表明该菌为属菌株，将WZM5-EPS菌剂喷施在土壤表面，可以形成一层生物结皮，具有保水保肥效果，且对棉花幼苗的生长具有明显地促进作用。天然生物结皮是由细菌、真菌、地衣、蓝绿藻、苔藓和非维管束植物组成的复合体，对控制荒漠化进程，阻止土壤沙化起着重要的作用。自然界中植物根系存在大量有益于农作物生长的微生物，很多固氮菌和具有生物防治功能的菌株也能同时合成EPS[18]，进一步研发复合EPS菌剂，对干旱、半干旱地区保持土壤养分和促进农作物生长可能更有利，研究经EPS菌剂处理后的砂土生态系统变化和“成土”过程，也将有助于荒漠化治理的理论研究。

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责任编辑：宗淑萍

Effect of WZM5-EPS agents on water and fertilizer conversation of soil, and the growth of cotton seedlings

WANG Yan-mei, REN Meng-nan, JIN Yu, LI Si-qi, HUANG Hai-dongCorresponding Author

（College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Strain WZM5, extracellular polysaccharide synthesis-bacteria, was isolated from soil of Ongniod desert, Inner Mongolia. Morphology and phylogenetic analysis based on 16S rDNA gene sequences showed that strain WZM5 belongs to the genus of, exhibiting the highest sequence similarity with（98.5%）. The fermentation broth of WZM5 belongs to thixotropic fluid, with high viscosity and excellent pseudoplastic. When the microbial agent of WZM5 was sprinkled on the surface of soil, the ability of soil water conservation and fertilizer conservation increased. The results showed that the ability of water retention in clay, loam and sand increased 49.2%, 83.9% and 42.3%, respectively, compared with the control. After leaching experiment, ammonium nitrogen leaching loss reduced 36.1%, phosphate fertilizer leaching loss reduced 96.5%, and potassic fertilizer leaching loss reduced 36.3% in sand. The results of pot experiment showed that cotton seed germination and seedling unearthed was not affected by WZM5-EPS microbial agent, but the growth of cotton seedling was promoted significantly.

microbial agent;; water retention; fertilizer retention

S157.9

A

1008-5394（2018）01-0001-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.01.001

2017-08-27

天津市大学生创新创业训练计划项目（201610061145）

王艳梅（1993-），女，本科在读，研究方向：生物技术。E-mail：1627300661@qq.com。

黄海东（1972-），男，教授，博士，从事资源及环境微生物方向的研究。E-mail：hhaidong@126.com。