用自拟的高效液相色谱法测定自制氨甲苯酸原料含量及有关物质的效果

王紫华

﹝上海现代哈森（商丘）药业有限公司，河南 商丘 476000﹞

氨甲苯酸是临床上常用的止血药。用该药进行止血的机制为：血液循环中存在各种纤溶酶（原）的天然拮抗物。氨甲苯酸可竞争性地阻滞纤溶酶原吸附在纤维蛋白网上，防止纤溶酶被激活、纤维蛋白被纤溶酶降解，从而发挥止血的作用[1]。现行的氨甲苯酸原料质量控制标准（用滴定分析法进行含量测定，用颜色控制终点）仅可对药品中的总杂进行控制，且操作过程较为繁琐、检测结果的误差较大[2]。有研究结果证实，用高效液相色谱法（HPLC法）测定氨甲苯酸原料含量的专属性要优于用滴定分析法进行测定的结果。在本次研究中，笔者根据《中国药典》（2010年版第二部）附录XIXA 药品质量标准分析方法验证指导原则[3]，在参考现行的氨甲苯酸原料质量控制标准的基础上，结合自制氨甲苯酸原料的合成工艺，用自拟的HPLC法测定氨甲苯酸原料的含量及有关物质，以期更好地控制该药品的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（包含流动相瓶、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、G1314F VWD检测器、Agilent chemStation 色谱工作站，由安捷伦公司生产）及CPA225D 电子分析天平（由赛多利斯公司生产）。

1.2 试药

氨甲苯酸对照品（批号：100921-200701，纯度：99.8%，购于中国药品生物制品检定所）、对氯甲基苯甲酸对照品（批号：20120421，纯度：99.9%，自制）、对氰基氯苄（批号：20120311，纯度：99.8%，由连云港三诺化工有限公司生产）、乙腈（为色谱纯）、水（为超纯水）、其他试剂（为分析纯）、氨甲苯酸原料样品（批号分别为S12052361、S12052461、S12052561，均为自制）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液和对照品溶液的制备方法

精密称取20 mg的氨甲苯酸原料样品（批号：S12052361），向其中加入水，将其溶解、稀释至50 ml。精密量取1 ml的该稀释液，向其中加入流动相，将其稀释至10 ml后混合均匀，将该溶液作为供试品溶液。精密称取20 mg的氨甲苯酸对照品（批号：100921-200701），用与配制供试品溶液相同的方法配制对照品溶液。供试品溶液和对照品溶液的浓度均为40 μg/ml。

2.2 自拟HPLC的色谱条件与系统适用性试验

2.2.1 色谱条件 色谱柱：氨基键合硅胶柱（Ultimate XBNH2，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈 -0.025 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（比例为69：31，用磷酸将其pH调节为4.0），样品的检测波长：235 nm，流动相的流动速度：1.0 ml/min，样品的进样量：10 μl，色谱柱的温度：30℃。

2.2.2 系统适用性试验 精密称取40 mg的氨甲苯酸对照品，向其中加入水，将其溶解、稀释至10 ml。精密量取1 ml的该稀释液，向其中加入流动相，将其稀释至10 ml后摇匀。分别按自拟的色谱条件和现行的标准色谱条件进样6次，结果显示，在自拟的色谱条件下，氨甲苯酸对照品溶液的主峰保留时间较短（可节约检测时间），且其峰对称性较好、塔板数较大、系统适用性良好、分离度和重复性均较好，证实该色谱条件优于现行的标准色谱条件。

2.3 自拟HPLC的检测限和定量限

取10.08 mg的氨甲苯酸对照品，将其置于50 ml的容量瓶中，向该容量瓶中加水，将其溶解、稀释至刻度，配制成100%溶液。取1 ml的该100%溶液，将其置于100 ml的容量瓶中，向该容量瓶中加入流动相至刻度，配制成1%溶液。取1 ml的该1%溶液，将其置于100 ml的容量瓶中，向该容量瓶中加入流动相至刻度，配制成0.01%溶液。取3 ml的该0.01%溶液，将其置入20 ml的容量瓶中，向该容量瓶中加入流动相至刻度，即得到氨甲苯酸检测限溶液的浓度（0.003204 μg/ml）。另取1 ml上述的1%溶液，将其置入10 ml的容量瓶中，向该容量瓶中加入流动相至刻度，配制成0.1%溶液。取1 ml的该0.1%溶液，将其置于20 ml的容量瓶中，向该容量瓶中加入流动相至刻度，即得到氨甲苯酸定量限溶液的浓度（0.01008 μg/ml）。分别精密量取10 μl的氨甲苯酸检测限溶液和定量限溶液，将这两种溶液注入液相色谱仪。在色谱仪的信噪比约为3时，得到氨甲苯酸的最低检出量。经计算，该最低检出量为0.03204 ng。在色谱仪的信噪比约为10时，得到氨甲苯酸的定量限。经计算，该定量限为0.1008 ng 。

2.4 自拟HPLC的线性范围

精密称取50 mg的氨甲苯酸对照品，向其中加水，将其溶解、稀释至50 ml后混匀。精密量取7份上述的稀释液，用流动相将其分别稀释成浓度为500 μg/ml、400 μg/ml、200 μg/ml、40 μg/ml、20 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml的溶液。按拟定的色谱条件，分别精密量取10 μl上述不同浓度的溶液进行检测，检测时的峰面积分别为23370.60、18855.00、9468.74、1917.07、956.20、190.74、94.94。以这7份样品的浓度为横坐标，以其峰面积为纵坐标作图，得出方程：y=46862x+30.378，r=1。结果表明，在拟定的色谱条件下，当氨甲苯酸对照品的进样量在2～500μg/ml范围内时，峰面积与样品浓度的线性关系良好，符合药典规定的分析方法验证要求。

2.5 自拟HPLC的精密度（重复性）试验

《中国药典》（2010年版第二部）规定：精密度是指在规定的测试条件下，对同一个均匀供试品进行多次测定后所得结果之间的接近程度。一般用相对标准偏差（RSD）对精密度进行考察（RSD≤1.0%）。取氨甲苯酸原料样品（批号：S12052361），将其分别配制成6份供试品溶液。用自拟的HPLC对这6份供试品溶液进行检测的结果显示，其含量分别为100.18%、99.99%、99.78%、99.83%、99.74%、99.70%，其含量的平均值为99.87%，其含量的RSD为0.2%。这一检测结果表明，该检测方法的精密度良好。

3 对氨甲苯酸原料样品中有关物质的检测

精密称取40 mg的氨甲苯酸原料样品（批号：S12052361），向其中加入水，将其溶解、稀释至10 ml。精密量取1 ml的该稀释液，向其中加入流动相，将其稀释至10 ml，制成供试品溶液。精密量取1 ml的供试品溶液，向其中加入流动相，将其稀释至100 ml，制成对照溶液。用自拟的HPLC检测3批（批号分别为S12052361、S12052461、S12052561，均为自制）氨甲苯酸原料样品的最大单杂和总杂（要求：最大单杂≤0.1%，最大总杂≤0.5%），结果显示，其单杂分别为0.028%、0.021%、0.020%，其总杂分别为0.042%、0.038%、0.033%。用现行的滴定分析法对这3批氨甲苯酸原料样品进行总杂（要求：最大总杂≤1.0%）检测的结果分别为0.030%、0.021%、0.020%。

4 对氨甲苯酸原料样品含量的测定

按“2.1”中使用的供试品溶液和对照品溶液的制备方法重新配制供试品溶液和对照品溶液，用自拟的HPLC法对新制备的供试品溶液和对照品溶液进行检测，按外标法计算其峰面积，结果显示，这3批氨甲苯酸原料样品的含量分别为99.61%、99.66%、99.58%。用现行的滴定分析法对这3批氨甲苯酸原料样品进行含量检测（要求：含量≥98.0%）的结果分别为99.86%、99.86%、99.85%。

5 讨论

5.1 用自拟的HPLC检测氨甲苯酸原料波长的选择依据

对氨甲苯酸溶液进行紫外扫描的结果显示，其在235 nm波长处有最大吸收。合成工艺的起始原料对氰基氯苄、中间体对氯甲基苯甲酸、氨甲苯酸自身的降解杂质在该波长处均能与主药进行良好的分离，且能被有效地检测，故选择235 nm作为用自拟的HPLC检测氨甲苯酸原料的波长。

5.2 用自拟的HPLC检测氨甲苯酸原料流动相的选择依据

在本次研究中，笔者将自拟HPLC的流动相﹝乙腈-0.025 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（比例为69：31，用磷酸将其pH调节为4.0）﹞与现行滴定分析法的流动相﹝乙腈-水溶液（比例为3：1，在200 ml的水中加入1滴冰醋酸，再加入4.0%的氢氧化钠溶液，将其pH调节至7.4）﹞进行了对比，结果显示，自拟HPLC的流动相其主峰保留的时间较短，其适用性较好，故将其作为检测氨甲苯酸原料的流动相。

[1]氨甲苯酸注射液说明书湖南洞庭药业股份有限公司[Z]. 2007.2.

[2]《中华人民共和国药典》1995年版.二部[S].1995:737-738.

[3]《中华人民共和国药典》2010年版.二部[S].2010:194-195.