低温β-甘露聚糖酶菌株的筛选鉴定及产酶条件的研究

李晓艳，杨旭颖，王 帆，迟乃玉

（大连大学 生命科学与技术学院， 辽宁 大连 116622）

β-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannan mannohydrolase,EC 3.2.1.78）是能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的多聚糖（如半乳甘露聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖）为甘露低聚糖的酶[1]，其作用底物是中β-甘露聚糖，而β-甘露聚糖是半纤维素的主要成份，半纤维素是自然界中第二大类杂聚多糖，广泛存在于槐豆胶、瓜尔豆胶、魔芋精粉等食用植物中[1]。而β-甘露聚糖酶以食用植物如魔芋粉、槐豆胶等为底物，水解形成的产物甘露低聚糖在食品、饲料、造纸、石油开采等方面广泛应用[2-5]。微生物发酵生产的β-甘露聚糖酶具有生产成本比较低、生产周期短、产酶量大酶活力高等优点，成为国内外理论和应用研究的热点。有关微生物生产β-甘露聚糖酶的研究主要集中在中温酶、高温酶产酶菌株的筛选[5]、响应面优化产酶条件[1,6-8]、酶的分离、制备工艺优化[9,10]、产酶基因的克隆与其表达[11-13]等多方面。国外(Yutaka Tamaru,O.Politz)[14,15]对海洋微生物产β-甘露聚糖酶基因进行研究，国内张云光等[16]对海洋细菌β-甘露聚糖酶进行菌株筛选研究，得到最适作用温度30℃产酶菌株。低温酶具有低温高效结构柔顺性、高催化活性、热不稳定性等特点，使其在应用上比高温酶、中温酶更有优势。低温脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等多种低温酶已经实现产业化生产，低温β-甘露聚糖酶研究与开发是大势所趋。

以大连星海公园的海水、海泥为样品，筛选生产低温β-甘露聚糖酶的菌株，得到1株高产低温β-甘露聚糖酶的菌株，根据其生物学特性及菌落特征对其进行初步分类鉴定，同时以其为研究对象，研究其产酶条件，为其发酵培养基的优化及工业化应用生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

以大连黄海海水、富含腐殖质的海泥为样品，筛选产低温β-甘露聚糖酶菌株。

1.1.2 培养基

（1）富集培养基(g/L)：魔芋粉5，瓜豆胶5，硫酸铵5，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾1，氯化钠5，pH自然，115 ℃ 0.75 Mpa灭菌20 min。

（2）分离培养基(g/L)：魔芋粉5，瓜豆胶5，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾1，氯化钠5，刚果红0.5，琼脂粉18，pH自然，115 ℃ 0.075 Mpa 灭菌20 min。

（3）种子培养基(g/L)：魔芋粉10，蛋白胨5，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾1，氯化钠5，pH自然，115 ℃ 0.075 Mpa 灭菌 20 min。

（4）产酶培养基(g/L)：魔芋粉5，蛋白胨5，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾1，氯化钠5，pH自然，115 ℃ 0.075Mpa 灭菌 20 min。

（5）斜面保藏培养基(g/L)：魔芋粉5，氯化钠20，琼脂粉18，pH自然，115 ℃ 0.075 Mpa 灭菌20 min。

（6）甘油保藏培养基(g/L)：魔芋粉5，酵母膏5，硫酸镁0.2，磷酸氢二钾1，氯化钠5，pH自然，115 ℃ 0.075 Mpa 灭菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集培养

取海泥或海水10 g放入装有100 mL无菌水的锥形瓶中，摇匀后静置30 min取上清液10 mL接种到富集培养基中，置于振荡培养箱中25℃ 160 r/min振荡培养28 h。

1.2.2 菌株的初筛

取富集培养液20mL放入500mL盛有180 mL无菌水及含40个玻璃珠锥形瓶中，160 r/min振荡30 min使样品均匀分散，稀释涂布装有鉴别培养基的平板25 ℃倒置培养，菌落周围形成透明圈的菌株为初筛菌株，透明圈直径与菌落直径之比为判定其酶活力重要指标。

1.2.3 菌株的复筛

挑取透明圈直径与菌落直径之比较大的菌株纯培养物一环，接种于种子培养基中，25 ℃ 160 r/min HZP-256全温振荡培养24 h为种子液，以3 %的接种量接种于发酵培养基中振荡培养28 h，用1 mL移液枪取1 mL发酵液于1.5 mL Tube管中，4 ℃8000 r/min离心10 min后，粗酶液为上清液。通过测定酶活力进行复筛。

1.2.4 酶活的测定方法

将魔芋粉溶于pH 6.0的磷酸钠缓冲液中配制20 g/L的溶液，此溶液为底物。取低温离心得到粗酶液0.1 mL加入到0.9 mL底物中，50 ℃水浴中10 min。加入2.0 mL DNS试剂，沸水浴5 min显色，立即以流动水冲洗冷却至室温，用去离子水定容至10.0 mL，以空白液调零，于540 nm处测定吸光度，即OD540。

1.3 低温 β-甘露聚糖酶菌株的鉴定

根据其个体生物学特性及菌落特征，同时参考《伯杰细菌鉴定手册》。

1.4 低温 β-甘露聚糖酶生产菌株的产酶曲线与生长曲线的测定

1.4.1 低温 β-甘露聚糖酶生产菌株的产酶曲线的测定

接种环挑取菌株一环接种于种子培养基，按照3 %接种量分别接入均装有6 mL种子培养基无菌试管40支，25 ℃ 160r/min恒温振荡培养。时间分别为0 h、4 h、6 h、8 h、10 h…40 h，按时间先后顺序测酶活。每次测两支试管取平均值计算该培养时间酶活，绘制产酶曲线。

1.4.2 低温β-甘露聚糖酶生产菌株的生长曲线的测定

接种环挑取菌株一环，接种于种子培养基，按照3 %接种量分别接入均装有6 mL种子培养基无菌试管40支，25 ℃ 160r/min恒温振荡培养。时间分别为0 h、4 h、6 h、8 h、10 h…40 h，按时间先后顺序测OD540。每次测两支试管取平均值，绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 低温β-甘露聚糖酶生产菌株的筛选与鉴定

采用以魔芋粉为唯一碳源的鉴别培养基平板初筛产低温β-甘露聚糖酶的菌株，通过测定酶活力进行复筛，进而获得产酶高且稳定性好的菌株。

海泥、海水中分离到产透明圈的菌株4株，选取产生透明圈最大、产酶稳定的一株命名为WYQ-01。由图1可知该菌株形成的菌落表面光滑、湿润、易于挑取、边缘整齐、边缘与中间厚薄不一、不透明、乳白色、直径大小为0.8 cm。由图2可以看出该菌产低温β-甘露聚糖酶，且所产生的低温β-甘露聚糖酶为胞外酶，透明圈直径大小为3 cm，透明圈与菌落直径比为3:0.8。由图3、图4可知该菌株为杆菌，革兰氏阴性，菌株长为2 μm、宽为0.6 μm。

图1 菌株WYQ-01菌落形态

图2 形成透明圈的菌株WYQ-01

图3 菌株WYQ-01革兰氏染色（10×100)

图4 图3放大10倍

2.2 低温 β-甘露聚糖酶生产菌株WYQ-01产酶曲线与生长曲线

由图5看出，菌株WYQ-01延滞期为0～14 h，对数期为14～26 h，稳定期为26～34 h，衰亡期为34～40 h。0～14 h时，两曲线均处于平缓状态，此时菌体生长处于延滞期，有代谢产物低温β-甘露聚糖酶的产生，与菌体生长呈现平行状态，是菌株WYQ-01生理、代谢必须的代谢产物，由此可知低温β-甘露聚糖酶为初级代谢产物。从16 h开始，两曲线均出现急速上升，此时菌体处于对数生长期，营养物质主要用于菌体的生长，伴随着大量代谢产物生成，稳定期28 h时产酶最多，酶活高达2175.225 U/mL。随着发酵周期的延长，菌体开始进入衰亡期，产酶量逐渐降低，是因为随着菌体生长，发酵液中营养物质逐渐耗尽、代谢产物大量积累、环境条件的改变致使产酶量下降。由此可知菌株WYQ-01最佳产酶时间为28 h。

图5 菌株WYQ-01生长曲线和产酶曲线

2.3 低温β-甘露聚糖酶生产菌株WYQ-01发酵条件的优化

对产低温β-甘露聚糖酶菌株WYQ-01采用单因素实验进行产酶条件优化，单因素包括温度、装液量、转速、pH和接种量等优化，每个因素设3个平行。

2.3.1 培养温度对产酶的影响

以3%的接种量取种子培养液接种产酶培养基中，分别在 10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃条件下160 r/min培养28 h后测定酶活。

由图6可知，在0℃～25℃，随着温度的上升，菌株产酶逐渐增多，25 ℃时产酶最多，酶活最高为2002.911 U/m L，20℃时的酶活为25 ℃的80 %左右，10℃时的酶活为最大酶活的20%左右。温度低于25℃时，产酶量极速下降。由此显示出菌株WYQ-01产生的低温β-甘露聚糖酶在低温环境中产酶量大且稳定性较高；当温度进一步升高时，酶活急剧降低，是因为高温引起酶的变性，使酶活的稳定性受到影响进而酶活下降，这体现出低温在高温下迅速失活的特性。由此可知最佳产酶温度为25 ℃。

图6 温度对菌株WYQ-01产酶的影响

2.3.2 装液量对产酶的影响

以3%的接种量取种子培养液接种容积为250 mL锥形瓶装液量分别为30 mL、50mL、80 mL、100 mL和120 mL产酶培养基中，25 ℃ 160 r/min振荡培养28 h测定酶活。由图7可知，装液量在30 mL～100 mL时，随装液量的增加，产酶量逐渐增大，装液量100mL时酶活最高为2050.781 U/mL。在100 mL～120 mL时随装液量的增加产酶量减少，酶活力降低，由此可知菌株WYQ-01产酶最佳装液量为100 mL，为锥形瓶容积体积的40%。装液量主要影响菌株生长对培养基中溶氧量需求，由此可见菌株WYQ-01在生长、产酶过程均需要氧气，为需氧微生物。

图7 装液量对菌株WYQ-01产酶的影响

2.3.3 转速对产酶的影响

摇床转速设定为5 0 r/min、110 r/min、130 r/min、160 r/min和 200 r/min，25 ℃ pH 7.0 装液量100 mL的产酶培养基以3%的接种量接种培养28 h测酶活。由图8可知，转速介于50 r/min～160 r/min，随着转速增加，酶活力随之增大，当转速为160 r/min时产酶量最大，酶活力最高为2112.056 U/mL。之后转速再增大产酶量下降， 130 r/min和200 r/min时，酶活分别为1832.491 U/mL和1847.809，仍具有85 %左右酶活力，说明菌株在有氧条件下生长较好，容易产酶。因此只有在产酶培养基中的溶解氧达到最适条件，才能使菌株产酶量达到最大，酶活力最大。大幅度提高振荡速度提高通气量和溶氧量，提高生产成本又降低产酶量。

图8 转速对菌株WYQ-01产酶的影响

2.3.4 起始pH对产酶的影响

以3%的接种量取种子培养液接种在pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的产酶培养基中，25℃ 160 r/min振荡培养28 h后测定酶活。由图9可知，在pH 5.0～7.0之间，随着pH的升高，产酶量增大，pH 7.0时产酶量最大，酶活力最高为2081.418 U/mL。在pH 7.0～9.0之间，随pH的再升高，产酶量减少，酶活力却快速降低。由此可知菌株WYQ-01酶活的最适pH为7.0左右。pH影响微生物生活环境中营养物质的供给、菌体细胞膜的带电性质、细胞膜的通透性、稳定性和膜对物质的吸收能力，进而影响微生物的生长及生理代谢，影响微生物产生代谢产物低温β-甘露聚糖酶。

图9 起始pH对菌株WYQ-01产酶的影响

2.3.5 接种量对产酶的影响

分别以1%、3%、5%、7%和10%接种量将种子接种于装液量为100 mL的产酶培养基中，25℃pH 7.0 160 r/min振荡培养28 h后测酶活。由图10可知，在接种量为1 %～3 %时，随着接种量的增加，产酶量逐渐增加，酶活逐渐升高，3 %时酶活力最高，为1981.147 U/mL。接种量在5 %～10%时，随着接种量增大，产酶量减少，酶活力降低，是因为菌体数量过多，菌体的生长及繁殖速度较快，营养物质快速消耗，致使在产酶阶段营养物质供应不足，产酶量减少，酶活力降低，因此菌株WYQ-01产酶的最佳接种量为3 %。

图10 接种量对菌株WYQ-01产酶的影响

3 结论

以大连星海公园海水、海泥为样品，通过以魔芋粉为唯一碳源的鉴别培养基筛选生产低温β-甘露聚糖酶菌株，得到产酶高稳定性好的1株菌，据个体生物学特性和菌落特征初步分类鉴定为细菌，将其命名WYQ-01。菌株为杆菌，长2 μm、宽0.6 μm，革兰氏阴性。菌株形成的单菌落表面光滑、湿润、易于挑取、边缘整齐、边缘与中间厚薄不一、不透明、乳白色、直径大小为0.8 cm。产生的低温β-甘露聚糖酶为胞外酶，透明圈直径大小为3 cm，透明圈与菌落直径比为3:0.8。

从菌株产酶的单因素条件进行研究：主要指产酶时间、温度、装液量、转速、pH和接种量六个条件。实验结果为：菌株WY-01培养28 h时酶活最高达2175.225 U/mL；最适产酶温度25℃，酶活为2002.911 U/mL；最适装液量为100 mL，酶活为2050.781 U/mL；最适振荡转速为160 r/min，酶活为2112.056 U/mL；最适产酶pH为7.0，酶活为2081.418 U/mL；最适接种量为3 %，酶活为1981.147 U/mL。在上述优化后的条件下，WYQ-01菌株发酵生产低温β-甘露聚糖酶酶活高达2275.265 U/mL。菌株WYQ-01在20℃时酶活是最适温度25 ℃的80 %左右，10℃时的酶活是25℃的20%左右，表明菌株WYQ-01产生的低温β-甘露聚糖酶在低温环境中产酶量大、酶活力高且稳定性较好，优势明显。温度35℃时酶活极速下降，体现出低温在高温下迅速失活的特性，该菌株产酶量大，酶活高是目前国内张云光[16]研究低温β-甘露聚糖酶的酶活70倍左右，具有潜在应用前景。