高效液相色谱法同时测定染发剂中10种染料组分

王海瑞 ,陈少波 ,徐振东

(1. 苏州出入境检验检疫局 检验检疫综合技术中心，江苏 苏州 215104；2. 苏州世标检测技术有限公司，江苏 苏州 215104)

随着社会生活水平的不断提高,人们开始注重自己的仪容仪表，染发作为美容的方式之一,染发人数逐年增多,同时中老年人群中染发者比例也呈上升趋势. 永久性染发剂多为氧化型染发剂，是由多种芳香族类化合物组成，而这些芳香族化合物的一些衍生物或者异构体具有一定的致敏性和致突变性[1]. 近年来因使用染发剂后出现接触性皮炎的报道越来越多,症状包括:头皮瘙痒、水肿、糜烂、低热、腹部肿大,甚至全身毛发脱落，其潜在的健康效应日益受到人们的关注. 我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)对染发剂中多种染料的使用进行了严格的规定.

目前染料的测定方法包括气相色谱法[2-3]、液相色谱法[4-7]、气相色谱-质谱法[8-9]、液相色谱-质谱法[10-11]和薄层色谱法等. 这些方法中，能够同时对多种组分进行定性定量分析，且具有较好分离效果的较少. 欧盟指令82/434/EEC推荐的薄层色谱法虽能较好的分离和鉴别各组分，但对其进行准确的定量分析具有一定的难度. 我国《化妆品安全技术规范》(2015版)7.2中采用高效液相色谱法检测了对苯二胺等32种组分，此方法使用不同的流动相，分为三组进行测定. 7.1 中采用高效液相色谱法检测对苯二胺等8种组分，此法分离效果不佳，存在峰型差等问题. SN/T 3829-2014 标准方法仅对2-硝基-p-苯二胺及其盐单一物质进行测定. 与其它仪器方法比较，采用气相色谱法和气相色谱-质谱联用法测定时，对毛细管柱和仪器的污染比较严重，采用液相色谱-质谱法的仪器成本较高，不具备普遍推广意义. 因此，有必要开发一种新的检测方法，既能满足多种染料组分的同时测定及定性、定量分析，且兼顾检测成本和普遍使用等要求.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Agilent 1260)，配有DAD检测器(美国安捷伦公司).

乙腈(色谱纯，安普)，无水乙醇(优级纯，沪试)，亚硫酸氢钠(分析纯,国药)，乙酸铵(分析纯，沪试)，标准品物质(Dr. Ehrenstorfer GmbH)

1.2 试样前处理

称取试样0.500 g于25 mL容量瓶中，加入无水乙醇和水(体积比为1∶1)并定容至刻度，涡旋，超声提取15 min(超声温度控制在20 ℃以下，减少染发剂中测定各染料组分的氧化)，取10 mL溶液于5 000 r/min条件下离心5 min，取上层清液，经0.45 μm滤膜过滤，滤液经液相色谱仪分析测定.

1.3 标准溶液的配制

分别称取100.00 mg标准品物质于10 mL容量瓶中，用2 g/L亚硫酸氢钠和无水乙醇(体积比为1∶1)溶解并定容，摇匀，配置成质量浓度为10 mg/mL的标准储备液，用无水乙醇配置成质量浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.50 mg/mL混合标准工作溶液.

1.4 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 Bonus-RP(100 mm×3.0 mm×2.7 μm)；流动相: 10 mmol/L乙酸铵-乙腈(洗脱条件如表1所列)；流速：0.5 mL/min；检测波长：280 nm；进样量：5 μL；柱温：25 ℃.

表1 洗脱条件Table 1 Elution conditions

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

《化妆品安全技术规范》2015版中,染发剂的两种检验方法分别使用了C18 柱(250 mm×4.6 mm×10 μm)和RP-AMIDE C16 柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)及保护柱： RP-AMIDE CAMIDE C16 (20 mm×4 mm×5 μm). 使用C18 柱测定对苯二胺等8种组分时，存在峰型有拖尾和分离效果差等现象；RP-AMIDE C16 柱对苯二胺等32种组分测定过程中，将32种组分分成了3组，使用不同的检测方法进行测定，对一个样品进行不同组别的组分进行测定时，要使用不同的检测方法分开测定，大大增加了检测周期和检测成本. 色谱柱Poroshell 120 Bonus-RP具有较强的耐水性，可直接用水相进行冲洗，测定染发剂中多种染料组分，具有峰型、分离效果好的特点，而且可以一次完成多种组分的同时测定.

2.2 流动相的选择

在选择流动相时，应避免很多标准方法中使用的相对复杂的磷酸盐混合缓冲溶液. 通过试验发现，采用乙腈和水按一定比例作为流动相分析时，流动相配制过程虽然方便快捷，但在出峰时间上具有重叠效应，分离效果相对较差，而采用乙腈+乙酸铵溶液作为流动相，分析过程能达到好的分离效果，因此最终确认采用乙腈和乙酸铵溶液梯度洗脱分析测定染发剂中染料组分.

2.3 色谱分析

根据对色谱柱和流动相优化后确定的仪器条件进行染发剂中多种染料组分的分析测定，得到如图1、2所示的液相色谱图. 其中，图1是根据每个单一标准品的保留时间和紫外光谱图进行定性分析，然后一一对应记录其编号. 定量分析则依据光谱图峰面积进行. 从图1、2可以看出，色谱图中各组分具有较好的分离效果.

图1 染料标准溶液液相色谱图(1) 对苯二胺，(2) 间苯二酚，(3) 对氨基苯酚，(4) 间氨基苯酚，(5) 4-氨基间甲酚，(6) 氢醌，(7) 4-氨基-2-羟基甲苯，(8) 2-硝基对苯二胺，(9) 甲苯-2,5-二胺硫酸盐，(10) 6-羟基吲哚Fig.1 Liquid chromatogram of dye standard soloution(1) p-phenylenediamine，(2) Resorcine，(3) p-Aminophenol，(4) m-Aminophenol，(5) 4-Amino-m-cresol，(6) Hydroquinone，(7) 4-Amino-2-hydroxytoluene，(8) p-Diamino-2-nitrobenzene, (9) 2,5-Diaminotoluene sulfate，(10) 6-Hydroxyindole

图2 某样品染发剂中液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of Some sample hair dye

2.4 线性关系与检出限

以空白样品基质配制一系列不同质量浓度的混合标准工作溶液(0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.50 mg/mL),以染料组分的峰面积Y为纵坐标，浓度值X为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，结果表明各染料组分在10～0.5 mg/mL范围内具有良好线性关系和相关系数，同时，以实际检测时的信噪比RSN≥3，得出方法检出限，结果如表2所列.

表2 线性方程、相关系数与检出限Table 2 Liner equations, correlation coefficients and detection limits

为检验方法的稳定性和重复性，对相同浓度的标准溶液进行10次重复进样，计算变异系数为0.65%～4.3%，表明本方法的重复性和稳定性良好.

2.5 回收率

采用标准加入法，在已知染料组分含量的某品牌染发剂中进行3水平(625.0、1 250.0、2 500.0 μg)6个平行的添加回收试验,按上述样品处理方法提取检测,计算各染料组分回收率和相对标准偏差. 在试验条件下，3个添加水平下各染料的平均回收率范围为87.3%～119.6%，相对标准偏差为0.87%～5.91%，如表3所列， 表明该方法回收率较高且稳定.

表3 染发剂中染料3个添加水平下染料组分加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of dye components in hair dye(n=6)

续表3

3 结论

试验表明,本文使用色谱柱Poroshell 120 Bonus-RP,通过液相色谱法可以同时测定染发剂中10种对苯二胺等染料组分，而且具有较好的分离效果和回收率.该法具有分析速度快、分析效果好等特点，可以快速完成大量大量的染料检验工作，这对染发剂中染料的测定具有较好的应用价值，对第三方检测具有一定的指导作用.

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