脾虚痰湿证代谢综合征患者肠道菌群的定量研究及其意义

陈　硕，牛天慧，孟凡荣，马建伟

代谢性疾病在我国及全球范围内均广泛流行并呈现明显的上升趋势。代谢综合征(metabolic syndrome, MS)作为多种代谢紊乱的集合状态，易导致心脑血管等多种重大慢性疾病的发生与发展。MS作为上述疾病重要“高危”因素及“前期”状态，对其进行深入研究意义重大。肠道菌群通过多种途径参与机体能量代谢，在代谢性疾病发生、发展过程中的作用已得到越来越多的重视，成为深入了解代谢性疾病新的切入点和靶点。传统医学中与肠道菌群最直接相关的理论为脾胃学说，既往大量研究证实，“脾虚证”与肠道微生态紊乱密切相关[1]。而脾虚失运与MS发生、发展密切相关，为其关键所在[2-3]。现代医学认为胰岛素抵抗为MS、糖尿病及肥胖症等代谢性疾病的共同“土壤”，且相关研究表明，肠道菌群的失调参与糖尿病、肥胖症等代谢性疾病的发生、发展[4-5]。故基于“脾虚理论”和“共同土壤学说”，本研究认为脾虚痰湿证MS患者存在肠道菌群失调并对其进行了初步研究。通过对肠道总菌属及主要菌群进行定量分析，以对比中老年脾虚痰湿证MS患者、气阴两虚证患者和健康人肠道菌群数量差异，以从微生态角度探讨脾虚痰湿证MS的可能病因，为MS的中医辨证分型提供客观依据，指导今后治疗。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2015年1月—5月于就诊于空军总医院中医科或内分泌科的脾虚痰湿证和气阴两虚证MS各40例患者的粪便标本，并选取同期30名健康体检者的粪便标本为健康对照组。其中脾虚痰湿证组男27例，女13例；年龄(55.14±1.22)岁。气阴两虚证组男24例，女16例；年龄(55.74±1.56)岁。健康对照组男18例，女12例；年龄(54.50±1.45)岁。3组研究对象性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2诊断标准参照MS 2013中华医学会糖尿病分会诊断标准，中医辨证分脾虚痰湿证、气阴两虚证，参照《糖尿病中医防治指南》(2009版)、《中药新药临床研究指导原则》(2002版)及临床观察制定[2-3]。

1.3纳入与排除标准

1.3.1纳入标准：①40～80岁，汉族，符合上述诊断标准的MS患者及常规检查无异常，身体状况良好的健康人群，性别不限；②近1个月内没有使用过抗生素、益生菌、益生元或胃肠动力药；③近1个月内无胃肠道疾病，如腹泻、便秘等；④无免疫性疾病、肝胆疾病及内分泌疾病病史；⑤受试者知情，并自愿签署知情同意书。

1.3.2排除标准：①排除标本留取过程中有明显污染者或DNA提取不合格者；②合并其他可能引起肠道菌群改变的疾病者；③既往胃肠道手术者；④近4周有重大手术及其他应激情况者。

1.4仪器与试剂荧光定量PCR仪ABI7500 System、PCR扩增仪(美国Perkin Elmer公司)，凝胶成像分析系统、紫外分光光度计SmartSpecTM3000(美国Bio-rad)，SYBR荧光定量PCR试剂盒(大连TAKARA公司)，pGM-T克隆试剂盒(VT202)，质粒小提试剂盒(DP103)，DH5α感受态细胞(CB101, TIANGEN)，粪便基因组提取试剂盒(DP328)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)，PCR mix，GeneGreen核酸染料(RT210)，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.5方法

1.5.1引物设计：根据16S rRNA V3序列设计各菌属的特异性引物，核对相应菌属特异性后进行引物合成。

1.5.2标准曲线构建：提取各菌群DNA，并采用紫外分光光度仪和1%琼脂糖凝胶电泳对提取后的各菌群DNA进行纯度和完整性的鉴定。以健康对照组粪便提取的菌群DNA为模版行普通PCR反应扩增，扩增产物经电泳鉴定合格后对各目标菌群DNA进行纯化回收，随后将纯化回收的各菌群DNA装入pGM-T载体构建重组质粒并转化至DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选得到阳性单克隆产物，后进行质粒抽提，质粒经测序验证符合后，即可作为标准品质粒。测得各菌属质粒浓度，利用Avogadro常数计算质粒拷贝数，作为标准品原液。对其做6～8个10倍梯度稀释，进行Q-PCR扩增，得到标准曲线。

1.5.3实时荧光定量PCR反应：应用实时荧光定量PCR检测系统对各样本进行扩增和定量检测。每次实验均同时做两个副孔并设阴性对照，反应结束后记录各菌属拷贝数。

2　结果

3组研究对象在肠道总菌群、球形梭菌、柔嫩梭菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌属和大肠杆菌数量比较差异具有统计学意义(P<0.05)。脾虚痰湿证组肠道总菌群、双歧杆菌、乳酸杆菌数量显著低于健康对照组，肠球菌属、大肠杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌数量显著高于健康对照组(P<0.05)。脾虚痰湿证组双歧杆菌数量显著低于气阴两虚证组，大肠杆菌数量显著高于气阴两虚证组(P<0.05)。气阴两虚证组总菌群数量低于健康对照组，肠球菌属数量高于健康对照组(P<0.05)。见表1。

表1　3组研究对象的各菌属细菌数量比较[M(Q)]

注：与健康体检组比较，aP<0.05；与气阴两虚证组比较，cP<0.05

3　讨论

MS在传统医学中无相应的病名，亦无系统论述，现代中医学者根据其主要临床表现多将其归属于中医学“脾瘅”、“肥满”、“湿阻”、“眩晕”、“胸痹”、“消渴”等范畴。《灵枢·卫气失常》篇中所述“肥满”、“膏人”具有“多气而皮纵缓，纵腹垂腴”的特点，而MS多存在腹型肥胖，故认为与此相对应[6]。综合古集记载及文献报道，多认为MS的基本病机为本虚标实，包括气血阴阳的不同，多涉及肝、脾、肾3脏，标实亦有痰、湿、瘀、热的差异。MS虽与诸脏腑功能失调有关，但与脾的关系最为密切，脾虚痰湿为其病机的关键所在，是其发生、发展的重中之重[2-3]。有学者认为痰湿是MS、糖尿病、肥胖等代谢性疾病的“温床”，是多种代谢性疾病的主要高危因素[7-8]。既往研究同样表明，MS的病位证素主要在脾，病性证素主要为痰湿，多有痰湿内盛的证候特点[9-10]。因此，脾虚痰湿是MS及多种代谢性疾病中医证候的主要特征，本研究对MS脾虚痰湿证患者肠道主要菌群的定量研究发现，脾虚痰湿证患者无论在菌属类型和菌群数量改变上均尤为明显，提示脾虚痰湿的根源可能与菌群失调密切相关。MS不同证型间肠道菌群存在差异，也进一步说明中医的“证”有其物质基础。

“脾胃为后天之本，气血生化之源”，传统医学的“脾胃”泛指整个消化系统，参与人体的能量吸收与转化，其与肠道菌群最为直接相关，20世纪90年代已有学者提出两者之间存在着密切的相应关系[1]。此后，中医微生态学不断被提出，并进行了逐渐深入的研究。从微生态角度对传统医学进行了多方面的阐述和分析，为中医“证候”的研究提供了客观依据，通过对“脾虚证”与肠道菌群相关性的研究，认为“脾虚证”与肠道菌群失调存在着密切的因果关系。刘佳等[11]观察了脾气虚、脾阳虚和脾阳虚兼脾气虚证老年患者肠道菌群的多样性差异，发现三者间肠道菌群结构存在显著差异，且各有其特异性。动物实验研究表明，采用“健脾”类方药，如四君子汤、补脾益气方、益元止泻颗粒和参苓白术散可增加实验小鼠肠道厌氧菌群数量，降低部分需氧菌数量，调节紊乱的肠道菌群[12-15]。并认为健脾止泻颗粒的治疗作用可能与其改善了小肠上皮细胞绒毛结构有关，而其结构的改善以肠道菌群稳态的恢复为前提[16]。健脾法能改善脾虚患者或大鼠失调的肠道菌群，从而改善脾虚证的主要症状，如乏力、纳差、腹泻等，提示健脾类方药是通过改善脾虚证患者失调的肠道菌群而缓解其临床症状，并最终达到治疗疾病的目的。

总之，结合本研究及既往相关研究结果发现，MS以脾虚痰湿证为主，其本质可能与肠道菌群的失调相关，提示健脾除湿可以通过改善肠道菌群失调达到治疗MS等多种代谢性疾病的目的。但由于本研究的局限性、中医证候的复杂性、肠道菌群的多样性以及既往研究的有限性，仅能初步证实MS脾虚痰湿证患者存在肠道菌群的失调，可能在MS的发生、发展及脾虚痰湿证的形成中起重要作用，但究竟是何种菌群起关键作用及其可能的作用机制均未明确，均有待进一步深入研究。

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