功能性鼻内镜手术治疗鼻息肉后血清抗EBV-LMP1抗体变化及临床意义

李志伟，杜伟强，缪　琴

鼻息肉是鼻部常见病，好发于成年人，且多见于上颌窦、筛窦、中鼻道及中鼻甲等处[1-2]。以往多采用药物保守治疗，但效果欠佳，目前临床上主张采用手术治疗，尤其是功能性鼻内镜手术效果较好，但仍有20%的复发率[3-4]。为进一步改进治疗方法，有学者研究发现86%患者鼻息肉组织中可检测到血清抗Epstain-Barr病毒-潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)抗体，并认为EBV感染可能与鼻息肉发病有重要关系[5]。故本研究检测鼻息肉患者手术前后与正常人群血清抗EBV-LMP1抗体水平情况，并分析抗EBV-LMP1抗体检测的临床意义，现报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2015年6月—2016年6月在本院收治的鼻息肉患者202例为研究对象。①纳入标准：均经功能性鼻内镜手术治疗，且术后病理检查确诊为鼻息肉；无手术并发症；无严重心、肝、肾等脏器功能损伤；均无精神及语言、沟通交流障碍；患者及家属知情且签署知情同意书。②排除标准：有手术禁忌证；有相关药物过敏史；同一时间段患者已参加其他相关研究调查项目。将202例鼻息肉患者设为观察组，选取同时间段的101名正常人设为对照组，并签署知情同意书。观察组男114例，女88例；年龄18～78(45.47±6.83)岁；对照组男54例，女47例；年龄19～79(45.38±6.75)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准同意执行。

1.2方法

1.2.1试剂：采用实验室表达与保存的谷胱甘肽-EBV-LMP1胞外区融合蛋白(GST-LMP1)、BSA及Tween-20购自美国Amreso公司，蛋白标准分子质量购自加拿大Fermentas公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色试剂盒购自美国Pierce公司；山羊抗人IgG-HRP购自中杉金桥公司。GAPDH Antibody-HRP购自美国GenScript公司。

1.2.2手术方式：给予患者行鼻窦冠状位CT扫描并掌握病变范围，全部患者均采用全身麻醉。待麻醉起效后，患者取仰卧位，术者根据Messerklinger术式依次切除钩突[6]，开放前后筛窦及蝶窦、额窦和上颌窦，鼻息肉严重者先切除鼻息肉，手术主要在Messerklinger鼻科电动吸切器下完成，术毕，将凡士林纱条和明胶海绵均匀填塞在患者的鼻腔内。

1.2.3ELISA检测血清中特异性抗体：手术前后抽取患者外周静脉血3～5 ml，3000 r/min离心20 min，分离血清待测。具体步骤如下：GST-LMP1融合蛋白用包被液1∶100稀释为100 ng/孔，50 μl/孔4℃过夜；弃上液，0.1% PBST(Tween-20)300 μl/孔，洗3次，甩干；加封闭液(PBS加5%脱脂奶粉)200 μl/孔，封闭2 h；弃上液，0.1% PBST(Tween-20)300 μl/孔，洗3次，甩干；每份血清以1∶100用封闭液稀释，加入100 μl/孔，阴性对照加封闭液100 μl/孔，37℃下孵育1 h；弃一抗，0.1% PBST(Tween-20)300 μl/孔，洗3次，甩干；加HRP偶联的二抗，50 μl/孔，置于湿盒内，37℃下孵育1 h；弃二抗，0.1% PBST(Tween-20)300 μl/孔，洗3次，纸上拍干；加入TMB显色液100 μl/孔；加终止液(2 mol/L的H2SO4)终止反应，ELISA读数仪读取OD值，重复实验3次。

1.2.4Western blot检测血清中特异性抗体：分为观察组与对照组，应用纯化GST-LMP1融合蛋白在12% SDS-PAGE上电泳。电泳结束，电转膜(BIO-RAD)300 mA，1.5 h后转至硝酸纤维膜。用封闭液(PBST加5%脱脂奶粉)封闭4℃过夜。观察组用一抗(PBS液1∶100稀释手术前后鼻息肉患者血清)；对照组用一抗(PBS液1∶100稀释正常人血清)，室温孵育1 h。PBST洗膜3次，每次5 min。加HRP偶联的二抗(1∶2500山羊抗人IgG抗体)，室温孵育1 h。PBST洗膜3次，每次5 min，DAB显色，双蒸水终止反应。重复实验3次。

2　结果

2.1抗EBV-LMP1抗体水平对比观察组术前以及术后第1、2、4和6个月的抗EBV-LMP1抗体水平分别为0.982±0.143、0.917±0.142、0.867±0.135、0.641±0.128和0.516±0.113，对照组为0.400±0.099。观察组术前抗EBV-LMP1抗体水平高于对照组(P<0.001)。术后第1和2个月，观察组抗EBV-LMP1抗体水平与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后第4和6个月，观察组抗EBV-LMP1抗体水平低于术前及术后第1和2个月(P<0.05)。

2.2条带相对灰度值对比术前、术后第1、2、4和6个月，观察组的条带相对灰度值分别为0.992±0.013、0.968±0.015、0.528±0.026、0.479±0.024和0.207±0.006，对照组为0.110±0.019。观察组术前条带相对灰度值高于对照组(P<0.001)。术后第1个月，观察组条带相对灰度值与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后第2、4和6个月，观察组条带相对灰度值低于术前及术后第1个月(P<0.05)。观察组术后第2、4和6个月的条带相对灰度值比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1Westernblot法检测鼻息肉患者和正常人血清抗EBV-LMP1抗体水平

1～5为鼻息肉患者术前、术后第1、2、4、6个月，6为正常人

3　讨论

鼻息肉的发病机制仍然属于医学研究的热点，但其病因复杂，至今尚未明确[7]。目前有以下几种学说，包括中鼻道微环境学说、鼻变态反应学说、嗜酸性粒细胞炎症学说、细菌超抗原学说等。但鼻息肉属于一种慢性炎症疾病，组织学表现为呼吸上皮遮盖着极度水肿的间质，间质中有炎性细胞浸润，作为一种以上皮细胞损伤和组织水肿为特征的炎症性病变，其发病机制存在多种可能[8]。而鼻息肉好发于双侧，单侧较少，持续性鼻塞且伴随息肉体积长大而加重较为常见[9-10]；且鼻腔内分泌物(浆液性或黏液性，如并发鼻窦感染，分泌物可为脓性)增多，会伴有喷嚏，有时会引起嗅觉障碍，鼻塞重者说话呈闭塞性鼻音，睡眠时打鼾，息肉蒂长者可感到鼻腔内有物随呼吸移动。后鼻孔有息肉时可致经鼻呼气困难，如息肉阻塞咽鼓管口，可引起耳鸣和听力减退，息肉阻塞鼻窦引流，可引起鼻窦炎，患者可出现鼻背、额部及面颊部胀痛不适等，严重影响患者的正常生活[11-12]。以往采用药物保守治疗效果欠佳，目前临床上主张采用以手术为主的综合治疗，尤其是功能性鼻内镜手术效果较好，认真进行术后随访及护理，能提高治愈率，但仍有20%的复发率[13-14]。

目前，鼻息肉主要以手术治疗为主，据有关学者统计，传统手术切除息肉术后复发率为30%～50%[15-17]。而采取功能性鼻内镜手术治疗，可彻底切除鼻息肉和息肉样变黏膜，重建鼻窦引流并为矫正鼻腔的解剖异常提供较传统手术更为优越的条件[18-19]。有学者研究认为，手术仅是治疗方案的第一步，而术后上皮再生恢复阶段尤为重要，且会向两个不同方向发展，其一可以愈合为主体，最终完成上皮化；其二可再生病变息肉或肉芽，结缔组织再生导致不全上皮而形成炎症，影响手术疗效甚至手术失败[20-21]。考虑到可能由于在慢性炎症的长期刺激下，黏膜的部分病理性改变不可逆，但有学者研究发现，鼻甲黏膜炎性细胞的浸润程度是预测鼻内镜术后是否复发的重要指标，有助于预测鼻内镜手术后是否存在部分鼻息肉症状[22]。

有学者研究EBV在上皮源性肿瘤发展中的作用与机制，尤其是EBV-LMP1与上皮源性肿瘤病因发病有密切的关系[23-25]。本研究发现，观察组术前抗EBV-LMP1抗体水平高于对照组。术后第1和2个月，观察组的抗EBV-LMP1抗体水平与术前比较差异无统计学意义。术后第4和6个月，观察组的抗EBV-LMP1抗体水平低于术前及术后第1和2个月。观察组术前条带相对灰度值高于对照组。术后第1个月，观察组条带相对灰度值与术前比较差异无统计学意义。术后第2、4和6个月，观察组条带相对灰度值低于术前及术后第1个月。观察组术后第2、4和6个月的条带相对灰度值比较差异无统计学意义。重复检测3次，结果一致，表明鼻息肉发病和EBV的感染有高度相关性，鼻息肉血清抗体水平较术前显著降低，并随术后随访时间的延长而下降，故可通过监测抗EBV-LMP1抗体水平的变化判定临床治疗效果。若水平升高，则预示疾病复发可能，需加强治疗；若水平维持不变或降低，则预示疾病逐渐趋于治愈，可继续原治疗方案。

综上所述，鼻息肉与EBV感染有相关性，功能性鼻内镜手术可有效地治疗鼻息肉患者症状，并随着术后综合治疗时间的延长，血清抗EBV-LMP1抗体水平降低，临床上可通过检测血清抗EBV-LMP1抗体水平作为评价该病的临床疗效指标。

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