昆明汉族人群VKORC1、CYP2C9基因多态性对华法林稳态剂量的影响及预测剂量模型的建立

肖成，胡莹，王玉明，徐梦云，李婉澜，柳杰

(昆明医科大学第二附属医院，昆明650000)

华法林是临床常用的香豆素类口服抗凝药，是治疗深静脉血栓、心房颤动、肺栓塞等血栓性疾病及心脏瓣膜置换术后的一线药物[1]。华法林因其治疗窗窄和患者个体差异等因素导致临床用药剂量难以评估。维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)和细胞色素P450(CYP)2C9基因多态性是华法林代谢出现差异的主要因素。通过检测这两种基因的多态性，可指导华法林的使用剂量，提高达标率并降低出血风险[2]。国际华法林药物基因组学联合会通过大量数据分析，推行了华法林剂量的运算平台。此平台通过结合VKORC1和CYP2C9基因信息以及患者临床资料(包括年龄、性别、体质量、种族、联合用药等)计算出华法林的个体化剂量，提高抗凝效果的同时大大降低了出血事件的发生。但该平台的数学模型是根据西方人群的特征建立的，是否适合中国人群还需研究。本研究通过分析VKORC1、CYP2C9基因多态性对华法林稳态剂量的影响，建立适合昆明地区汉族人群华法林预测剂量的数学模型，指导血栓性疾病患者的个体化用药。

1　资料与方法

1.1　临床资料

选择昆明医科大学第二附属医院2015年10月～2017年2月使用华法林治疗的下肢深静脉血栓患者162例，其中男96例、女66例，年龄(57.26±14.17)岁，身高(164.22±8.20)cm，体质量(64.09±12.59)kg，BMI(23.71±4.03)kg/m2。另外选取临床资料相匹配的下肢深静脉血栓患者20例，用于华法林预测剂量模型的验证。纳入标准：规律服用华法林片，且3次随访国际化标准比值(INR)范围在1.7～3.0的昆明籍汉族成年患者。排除标准：严重肝肾功能不全、甲状腺功能异常、肿瘤、结缔组织疾病、心力衰竭患者及妊娠妇女，同时服用与华法林药效动力学及药物动力学相互影响的药物者[3]。本研究经医院伦理委员会批准，获得患者知情同意。

1.2　VKORC1、CYP2C9基因多态性检测

采集患者服用华法林后12 h空腹静脉血3 mL，使用血液基因组DNA提取试剂盒(DP318，北京天根生化公司)提取DNA，采用荧光PCR法和PCR-荧光探针法检测等位基因位点，使用VKORC1基因检测试剂盒和CYP2C9基因检测试剂盒(北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司)检测VKORC1、CYP2C9基因型。采用25 μL的扩增阻滞突变体系-聚合酶链式反应技术(ARMS-PCR)反应体系。12.5 μL PCR反应液，6.5 μL引物探针混合液，4 μL超纯水，2 μL基因组DNA。扩增程序：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸35 s，共40个循环，用以检测等位基因位点。

1.3　华法林个体化预测剂量模型的建立及评价

收集患者的临床资料，包括性别、年龄、身高、体质量、BMI、INR、华法林稳态剂量、VKORC1和CYP2C9基因型，采用Pearson相关分析法筛选华法林稳态剂量的相关因素；综合华法林稳态剂量的相关因素进行多元逐步回归分析，得到预测剂量模型。对162例患者进行6个月的随访。对20例验证人群给予华法林预测剂量模型所推荐剂量，观察用药后出血性事件的发生情况，其评判依据出血学术研究会(BARC)[4]制定的标准。

1.4　统计学方法

2　结果

2.1　CYP2C9和VKORC1基因多态性检测结果

CYP2C9基因有151例野生型纯合子AA型(93.21%),11例杂合子AC型(6.79%)，无突变CC型。VKORC1基因有138例野生型纯合子AA型(85.19%),22例杂合子AG型(13.46%),2例纯合子GG型(1.35%)。VKORC1、CYP2C9基因型组合可获得6种组合：128例AA/AA、21例AA/AG、2例AA/GG、10例AC/AA、1例AC/AG、0例CC/GG。各组合符合Hardy-weinberg遗传平衡定律的分布频率(P>0.05)[5]。

2.2　CYP2C9和VKORC1不同基因型患者的华法林稳态剂量比较

CYP2C9 AA、AC型华法林稳态剂量分别为(2.97±0.65)、(2.51±0.72)mg，AC型华法林稳态剂量低于AA型(P<0.05)；VKORC1 AA、AG、GG型华法林稳态剂量分别为(2.81±0.58)、(3.68±0.67)、(3.40±1.03)mg，AA型华法林稳态剂量低于AG型和GG型(P均<0.05)。

2.3　华法林预测剂量模型建立情况

通过Pearson相关性分析后显示，华法林稳态剂量与VKORC1和CYP2C9、体质量、年龄相关(r分别为0.398、-0.172、0.211、-0.558，P均<0.05)；与身高、BMI、INR无明显相关(P均>0.05)。对患者年龄、体质量、VKORC1和CYP2C9基因型进行稳态剂量的多元线性回归分析，结果显示，年龄、体质量及VKORC1和CYP2C9基因型是华法林稳态剂量的影响因素(P<0.05或<0.01)。见表1。采用华法林稳态剂量结合对VKORC1、CYP2C9、年龄和体质量进行多元回归分析，得到最佳预测剂量模型：华法林用量=3.401-0.027×A+0.015×W-0.312×CYP2C9+0.979×(VKORC1-X1)+0.64×(VKORC1-X2)。对于CYP2C9，AA型输入0，AC型输入1。对于VKORC1，AA型在(VKORC1-X1)和(VKORC1-X2)均输入0；AG型在(VKORC1-X1)输入1，(VKORC1-X2)输入0；GG型在(VKORC1-X1)输入0，(VKORC1-X2)输入1。采用非参数Spearman相关分析法对华法林预测剂量与稳态剂量分析后得出二者具有相关性(r=0.816，P<0.01)。

表1　　　　下肢深静脉血栓患者华法林稳态剂量相关因素的多元线性回归分析结果

2.4　华法林预测剂量模型应用评价结果

162例患者随访期间均无重大出血事件发生。出现轻度出血事件18例，其中表皮黏膜出血17例、便血1例。18例患者的基因型分别为AA/AA型13例、AC/AG型3例、AC/GG型2例，各型出血事件的发生率分别为9.42%、27.27%、18.18%。使用预测剂量模型推荐华法林用量的20例患者随访期间无出血事件发生。

3　讨论

华法林作为一种香豆素抗凝剂在临床上广泛应用。华法林有S和R两种对映体。其中S型抗凝活性比R型高3～5倍[6]，其代谢分别由CYP2C9和CYP1A2同工酶催化。CYP家族中CYP2C9基因的多态性影响华法林的使用剂量[7]。CYP2C9是CYP第7号外显子的第359位氨基酸，若1075位的A碱基替换为C碱基(1075A>C)，则会导致亮氨酸突变为异亮氨酸[8]，这种替换会降低CYP2C9的活性，从而延迟华法林的清除速率及代谢，进一步延长华法林的疗效、减少其维持剂量。VKORC1基因多态性将影响维生素K氢醌状态的维持，此过程可影响维生素K依赖性凝血因子凝血Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的γ-羧化[7]。VKORC1基因突变则会导致对华法林的抵抗[9]。

随着药理学结合分子生物学的发展，研究人员通过对患者进行基因检测并结合患者临床资料建立符合当地人群的华法林个体化给药模型。国内外此类模型的建立可以为华法林的用药提供帮助。有研究报道称性别、年龄、体质量、INR等非遗传因素可以解释12.6%的华法林剂量差异，而CYP2C9和VKORC1的基因多态性等遗传性因素，可解释33%～60%的华法林剂量差异[10]。

本研究综合分析经华法林治疗的162例患者的资料，结果显示华法林稳态剂量与VKORC1和CYP2C9、体质量、年龄相关，与身高、BMI、INR无关。另外选取的20例患者作为验证人群，对所建立的华法林预测剂量模型进行随访验证，结果证实该模型具有有效性。因此，可结合患者的临床特征运用本研究所建立的预测剂量模型进行实验性给药。本研究对入选的162例患者进行VKORC1和CYP2C9基因检测，结果显示VKORC1和CYP2C9基因AA型分布频率为85.2%和93.2%，与刘俊等[11]报道的结果相似，而CYP2C9基因AC型的分布频率略高于文献报道的4.93%。分析其原因为云南汉族人群中混有少数民族基因。VKORC1 AG和GG型的分布频率为13.6%和1.2%，基本与文献[12]报道相符。Yuan等[13]研究发现，VKORC1 AG和GG型的VKORC1 mRNA表达水平高于AA型。这会引起VKORC1活性增高，导致产生更多的凝血因子，增加华法林的用量。本研究也验证了上述发现，VKORC1 AG和GG型的稳态剂量均高于AA型。经过6个月的随访，发现18例患者发生了较轻微的出血事件。其中AA/AA型13例、AC/AG型3例、AC/GG型2例。AC/AG型和AC/GG型患者使用华法林稳态剂量后发生的出血事件的比例较多，可能与本研究这两组基因型的样本量较少有关，后续可扩大样本量行进一步的研究。

本研究存在诸多不足之处。研究认为女性患者体内的雌激素作用会导致药物代谢的个体差异性显著大于男性[14]。本研究未对男女患者分别统计其华法林的使用情况。种族差异也会导致基因分布频率的不同，本研究在入选病例时未咨询双亲中是否有一方为少数民族。遗传因素会影响老年患者应用华法林的效果[10]，本研究未对年龄进一步分层，可进一步扩大样本分别分析不同年龄段各种因素对华法林用药的影响。其他基因多态性也会影响华法林的使用剂量，如CYP4F2基因、γ-谷氨酰基羧化酶、载脂蛋白E、微粒体环氧化物水解酶编码基因等[15]，本研究未考虑此类基因的影响。另外，还需对患者是否吸烟、饮酒及高血压史进行综合分析。

分子生物学检测结合预测模型公式用于计算华法林的用量在临床上的应用仍存在诸多争议。华法林作为药物基因组学研究的热门药物虽广泛应用于临床，但其临床研究并不多，而且大多数为国外研究，我国则多为维持剂量的回顾性分析。针对黄种人或汉族人群的负荷剂量、维持剂量的基因型与剂量运算模型的研究相对较少且缺乏验证。本研究所建立的华法林个体化预测剂量模型可为昆明地区汉族人群提供较为准确的指导，未来仍需扩大样本量并结合更多相关因素进行综合研究，以保证华法林用药的精准和有效。

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