耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLST联合SCCmec基因分型与耐药性分析*

纪冰，王凯凯，赵红梅，董艳，孟玮，邢敏，孙吉花

（滨州医学院附属医院 1.检验科，2.感染管理办公室，山东 滨州 256603）

金黄色葡萄球菌是临床分离常见致病菌，由于可以释放多种毒素等原因造成致病力很强，是现代临床感染性疾病中非常重要的病原菌[1]。金黄色葡萄球菌在获得mecA基因后成为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Meticillin - resistant staphylococcus aureus，MRSA），MRSA对多种抗生素表现多重耐药且耐药性逐年上升，已经成为现代临床抗感染治疗的难题之一[2]。本研究通过多位点测序分型联合SCCmec基因分型对MRSA进行基因分型以了解滨州医学院附属医院的主要流行株情况，并探讨不同基因型与药敏谱的关系，明确MRSA的起源、传播和流行特征，制定本地区最佳防治措施。现报道如下。

1　资料与方法

1.1　菌株来源

收集本院2013年3月-2015年11月临床分离的经德国西门子公司WalkWAY96 PLUS全自动微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌，头孢西丁纸片扩散法进行筛选，用PCR方法检测mecA基因确认为MRSA共67株。金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213和ATCC43300购于中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会临床检验中心。

1.2　仪器和试剂

WalkWAY96 PLUS全自动微生物分析仪，溶葡萄球菌酶、细菌DNA提取试剂盒、引物、1 000 bp DNA ladder Marker、PCR试剂均购自上海生物工程有限公司，PC33鉴定药敏复合板购自德国西门子公司。

1.3　药物敏感试验

采用WalkWAY96 PLUS自动微生物分析仪PC33鉴定药敏复合板和Kirby-Bauer法检测抗菌药物的敏感性，共测试17种抗菌药物，分别为：青霉素、氨苄西林、苯唑西林、利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素、环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、氯霉素、克林霉素、红霉素、庆大霉素、利福平、四环素、复方新诺明及米诺环素。

1.4　SCCmec基因分型检测

对金葡菌DNA提取后进行多重PCR扩增，分型引物/扩增及反应条件均依据ZHANG等[3]的报道，根据扩增条带分为5型。标准阳性对照菌株：NCTC10042（SCCmecⅠ型）、N315（SCCmecⅡ型）、85/2080（SCCmecⅢ型）、JCSC4744（SCCmecⅣ型）、HS663（SCCmecⅤ型）由滨州医学院微生物教研室张玉梅惠赠。标准阳性对照菌株保证在规定实验条件下，保证每次结果的质量控制，与标准菌株出现相同产物长度条带为该SCCmec型别，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及V型分别出现613、398、280、776及325 bp条带。

1.5　MLST分型

提取金黄色葡萄球菌DNA后进行PCR扩增金葡菌染色体DNA上的7个管家基因arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi及yqiL的可变区片段。引物序列依据MLST网站，PCR扩增后PCR产物送上海生物工程公司进行双向测序，将所测序列与WWW.mlst.net上公布的管家基因的等位基因进行比较，从而获得所测金黄色葡萄糖球菌的7个管家基因的等位基因谱，然后提交MLST网站根据等位基因谱确定其序列分型（sequence type，ST）。利用eBURST软件分析ST分型结果，最后得出细胞克隆株（clonal complex，CC）来源。

1.6　方法

采用eBURST软件分析ST分型结果，采用Whonet 5.6软件进行细菌耐药性分析。

2　结果

2.1　SCCmec基因分型结果

在检测的67株MRSA中，SCCmecⅢ型菌株63株，占94.03%，SCCmecⅣ菌株4株，占5.97%。SCCmecⅢ型和SCCmecⅥ型阳性对照菌株与检测阳性菌株产物分别于280和776 bp出现条带。PCR扩增结果见附图。

2.2　MLST分型结果

经PCR分别扩增67株MRSA的7个管家基因，扩增后的PCR产物经纯化后测序，最后提交MLST网站分析，本研究共检出6个ST型。见表1。

附图　MRSA的SCCmec多重PCR扩增产物电泳图谱

2.3　不同基因型的药物敏感试验结果

6种型别MRSA菌株对青霉素、氨苄西林等β-内酰胺类抗生素完全耐药，对万古霉素、利奈唑烷和替考拉宁完全敏感，ST239-MRSA-SCCmecⅢ、ST399-MRSA-SCCmecⅢ及 ST121-MRSA-SCCmecⅣ均为多重耐药株（对3种类型以上的抗菌药物耐药），ST88-MRSA-SCCmecⅣ、ST221-MRSA-SCCmecⅣ及ST82-MRSA-SCCmecⅣ对非β-内酰胺类的抗菌药物多表现敏感，为非多重耐药。见表2。

表1　67株MRSA的MLST结果

表2　不同ST-MRSA-SCCmec基因型别耐药率 %

3　讨论

金黄色葡萄球菌可以引起医院和社区诸如心内膜炎、菌血症、肺炎等可危及生命的严重感染性疾病，由于金黄色葡萄糖球菌在获得mecA基因成为MRSA后的多药耐药性和交叉耐药性特点使临床治疗非常棘手，致临床治疗难以控制，目前已成为临床抗感染治疗的一大难题，现在不同地区MRSA的起源、控制医院内传播和耐药特征已成为国内外耐药监测和流行病学监测的热点和重点。在众多基因分型方法中，由ENRIGHT等[4]建立的MLST联合SCCmec基因分型方法将MRSA的群体生物学、致病性和进化等遗传特征和SCCmec染色体盒耐药基因特征相结合对MRSA进行分析，该技术操作简单易行，可重复性强，由于有固定MLST互联网站数据库故可以实现不同实验室之间进行信息互相传递和比较分析，现在已被国际临床微生物界认定是定义MRSA克隆株的参考方法，适用于公共卫生、分子流行病学和群体进化学研究。通过对国际上的MRSA进行MLST联合SCCmec基因分型技术分型发现目前主要有5个MRSA流行克隆：ST250-MRSA-SCCmecⅠ（First株 ）、ST247-MRSA-SCCmecⅠ（Iberian株 ）、ST5-MRSA-SCCmecⅡ（NewYork/Japan株）、ST239-MRSA-SCCmecⅢ（Brazilian/Hungarian株）及ST5-MRSA-SCCmecⅣ（Pediatric）。本研究 67株 MRSA流行的主要是ST239-MRSA-Ⅲ，与大部分亚洲国家[5]和国内杨延成[6]研究ST239-MRSA-Ⅲ主要流行株相同，ST239-MRSA-Ⅲ属于国际流行克隆株中的Brazilian/Hungarian株，也是我国医院获得性感染MRSA主要流行株，而研究中ST399-MRSA-SCCmecⅢ、ST121-MRSA-SCCmecⅣ、ST88-MRSA-SCCmecⅣ、ST221-MRSA-SCCmecⅣ及ST82-MRSA-SCCmecⅣ都不是国际流行克隆株，在国内外也能散发检测到，要求进一步研究其基因特征来确定菌株起源。63株SCCmecⅢ型MRSA有2型ST型别，相对于SCCmecⅢ型MRSA，SCCmecⅣ型MRSA显示了更为多样化的ST分型特点，4株就检测出4型不同的ST型别。所以SCCmecⅣ型MRSA菌株与SCCmecⅢ型相比具有完全不同菌株起源背景和进化路线，提示在滨州医学院附属医院SCCmecⅣ型MRSA可能存在独特的遗传背景和进化传播方式。MLST联合SCCmec基因分型技术的最主要优势是已经建立了存有大型基因型数据库的国际网站，不同国家，不同地区的实验室可以将自己的检测结果提交基因型数据库与公认的已有的流行株进行比较和分析，可以对不同实验室分离的MRSA的遗传背景和进化传播路线进行相关性分析，实现世界范围内的流行病学调查，监测是否出现国际流行MRSA克隆株，这样可以防止和控制国际流行MRSA株感染的爆发和流行。

SCCmec分型与药物敏感试验结果结合分析显示SCCmecⅢ型的MRSA株均表现为多重耐药（对3类药物及以上耐药定义为多重耐药），而SCCmecⅣ型MRSA均未表现为多重耐药，药物敏感试验结果显示对红霉素、左氧氟沙星等非β-内酰胺类的抗菌药物多为表现为敏感，现有研究已经明确Ⅲ型与Ⅳ型MRSA耐药性差异与不同型别SCCmec基因盒基因结构差异有关[7]。在目前明确的SCCmec分型中，I、Ⅱ、Ⅲ型SCCmec基因盒基因元件结构比较复杂，特别是存在于该3种SCCmec基因盒上的IS431等插入序列有吸引非β-内酰胺类药物耐药基因的作用，能将多种非β-内酰胺类药物耐药基因整合到SCCmec基因盒中，使之携带多种耐药基因并表现为对多种非β-内酰胺类药物耐药。多项研究显示SCCmecI、Ⅱ及Ⅲ型常存在于医院获得性MRSA（hospital aquired MRSA，HA-MRSA）中引起医院获得性感染；SCCmecⅣ型和V型基因盒基因元件比较简单，不存在吸引其他耐药基因的元件结构，所以一般不携带其他非β-内酰胺类药物耐药基因，本研究显示SCCmecⅣ型菌株为非多重耐药菌。SCCmecⅣ和V型菌株多存在于社区获得MRSA中，由于其可引起暴发流行和菌株不表现为多重耐药现在已成为研究的热点[8]。对于MRSA临床医师经验性治疗第一选择仍为万古霉素，药敏结果显示MRSA未发现耐万古霉素菌株，但由于万古霉素的广泛应用已出现万古霉素MIC上升趋势，使万古霉素使用受到一定限制，国际上更出现万古霉素耐药菌株，为了减缓万古霉素抗生素压力防止我国出现万古霉素耐药金葡菌，本研究根据药物敏感结果提示携带SCCmecⅢ型的医院获得性MRSA株对莫西沙星、氯霉素及米诺环素耐药率较低，经验治疗时可考虑优先选择使用这些抗生素，而对SCCmecⅣ型菌株对非β-内酰胺类的抗菌药物敏感性较好，经验治疗社区获得MRSA可以选择左氧氟沙星、红霉素及克林霉素等多种抗生素。

由于MRSA的致病性强、传播速度快和多重耐药性，其引起的社区和医院感染如果监测和控制不当，容易引起院内或社区感染的暴发，严重威胁人类健康。故在医院和社区进行MRSA起源、传播和进化、抗菌药物敏感性试验的研究监测，明确本地区MRSA流行株和尽早发现新的MRSA克隆株的播散，可以根据MRSA菌株起源及传播特点并获取耐药机制，为制定有针对性的预防和控制措施提供有力证据和方法，能有效减少MRSA菌株的传播和流行。

参 考 文 献：

[1]仇广翠, 孙明忠, 金浩. 220株金黄色葡萄球菌的临床分布特点及耐药性分析[J]. 中国实验诊断学, 2016, 20(2): 269-271.

[2]KUMARI J, SHENOY S M, BALIGA S, et al. Healthcareassociated methicillin-resistant staphylococcus aureus: Clinical characteristics and antibiotic resistance profile with emphasis on macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance[J]. Sultan Qaboos UnⅣ Med J, 2016, 16(2): 175-181.

[3]ZHANG K, MCCLURE J A, ELSAYED S. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant staphylococcus aureus[J]. J Clin Microbiol,2005, 43(10): 5026-5033.

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[5]FEIL E J, NICKERSON E K, CHANTRATITA N, et al. Rapid detection of the pandemic methicillin-resistant staphylococcus aureus clone st 239, A dominant strain in asian hospitals[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(4): 1520-1522.

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