shRNA沉默趋化素对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖能力的影响及可能的机制*

牛美芝，杨辉，刘福垒

（1.山东省肥城矿业中心医院 心内科，山东 肥城 271608；2.山东省泰安市中心医院，山东 泰安 271000）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）作为严重威胁人类健康的常见病，近年来发病率呈逐年上升趋势，冠状动脉粥样硬化是其重要的病理基础[1]，研究表明[2]，冠状动脉粥样硬化作为血管壁的一种慢性炎症疾病，是炎症反应、血管内皮细胞功能异常、血管平滑肌细胞异常增殖及迁移等共同作用的结果。有研究指出[3]，血管平滑肌细胞增殖及迁移异常在动脉粥样硬化发生及进展中发挥基础性作用。趋化素（Chemerin）作为新发现的一种趋化因子和脂肪因子，与肥胖、糖脂代谢异常等密切相关[4]，研究发现[5]，Chemerin在人冠状动脉周围脂肪组织及冠状动脉病变部位的血管平滑肌细胞中高表达。亦有研究指出[6]，Chemerin与其受体人趋化因子样受体1（chemokine receptor-like 1，CMKLR1）结合通过活化下游相应信号通路而参与了冠心病发生及进展过程。本研究通过转染Chemerin基因RNA干扰慢病毒载体，观察其对小鼠主动脉平滑肌细胞（aortic smooth muscle cell，ASMC）增殖能力的影响，并探讨可能的机制。

1　材料与方法

1.1　主要试剂与设备

SPF级ICR小鼠购自河南省实验动物中心[许可证号SCXK（豫）2010-0002]，雌雄不限，8～10周龄，饲养于标准环境下。DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素混合液均购自美国Gibco公司，0.25%胰蛋白酶、Trizol总RNA提取试剂盒和Lipofectamine 2000转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司，慢病毒表达载体试剂盒购自日本TaKaRa公司，293T包装细胞购自广州赛业生物公司，血小板源性生长因子-BB（platelet-derived growth factor，PDGF-BB）购自上海古朵生物科技有限公司，逆转录试剂盒和聚合酶链反应试剂盒均购自大连宝生物公司，Chemerin及内参引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，兔抗小鼠α平滑肌肌动蛋白抗体购自北京中衫金桥生物技术有限公司，小鼠抗大鼠Chemerin单克隆抗体购自美国Enzo Life Sciences公司，兔抗鼠细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）单克隆抗体购自美国Cell Signalling公司，小鼠抗大鼠p-ERK1/2多克隆抗体、鼠抗c-Jun氨基末端激酶（JNK）单克隆抗体购自美国Biosource公司，鼠抗p-JNK单克隆抗体购自上海瑞齐生物科技有限公司，兔抗山羊二抗购自武汉博士德生物技术有限公司，5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）抗体购自美国Sigma公司，凝胶电泳分析系统购自美国Bio-Rad公司，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）仪购自美国ABI公司。

1.2　方法

1.2.1Chemerin基因RNA干扰慢病毒载体构建及鉴定根据小鼠Chemerin基因mRNA序列为干扰靶点，设计其靶向干扰的短发夹RNA序列（shRNA），正向：5'-GATCCGCTTTGTGAGGTTGGAATTTAATTCAAG AGATTAAATTCCAACCTCACAAAGTTTTTTACGCGT G-3'，反向：5'-AATTCACGCGTAAAAAACTTTGTGAG GTTGGAATTTAATCTCTTGAATTAAATTCCAACCT CACAAAGCG-3'。根据试剂盒说明书，构建利用293T细胞对慢病毒进行包装，采用梯度稀释后，利用荧光计数对病毒滴度进行检测。

1.2.2小鼠ASMC培养、鉴定及分组利用颈椎脱臼法将小鼠处死，无菌操作下将胸主动脉取出，用眼科剪剪成小块状，胰酶预消化后，利用组织块贴壁法对ASMC进行原代细胞培养。细胞贴壁生长后进行传代培养，并采用免疫荧光法对ASMC进行鉴定。取传代培养细胞，分成4组：Sham组、PDGF组、对照序列组和Chemerin沉默组，其中，Chemerin沉默组和对照序列组分别用携带Chemerin干扰基因和对照基因序列的慢病毒进行感染，分别向PDGF组、对照序列组和Chemerin沉默组细胞中加入终浓度为20 ng/ml的PDGF-BB，Sham组则加入等量的PBS。

1.2.3qRT-PCR检测各组细胞中Chemerin基因表达取各组传代培养48 h细胞，加入细胞裂解液进行裂解，用Trizol总RNA提取试剂盒对总RNA进行提取，用紫外分光光度计对总RNA纯度进行检测，取A260/A280≥1.80作为合格样品。用逆转录试剂盒进行逆转录，获得模板单链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。引物序列：Chemerin引物，正向：5'-TACAGGTG GCTCTGGAGGAGTTC-3'，反向：5'-CTTCTCCCGTTTG GTTTGATTG-3'；β-actin 引物，正向：5'-AGCCATGTA CGTAGCCATCC-3'，反向：5'-CTCTCAGCTGTGGTGGT GAA-3'。PCR 反应条件：92℃ 1 min，92℃ 30 s，58℃30 s，73℃ 30 s，连续进行 40次循环。用2-△△Ct法获得各组细胞中Chemerin基因相对表达量。

1.2.4细胞计数实验取各组细胞，胰酶消化后离心，接种于96孔板中，调整细胞密度为1×104个/孔，每组设置6个反应复孔，4～6 h后改用100μl完全培养基进行培养。在加入PDGF-BB后培养48 h时，去除培养基，用含EDTA的胰酶30μl消化后，加入培养液70μl，充分吹打，使细胞充分混合均匀，取细胞悬液10μl，于显微镜下利用计数板对各组细胞进行计数。

1.2.5BrdU掺入法测定各组细胞增殖能力取各组传代培养48 h细胞，接种于96孔板，将10μmol/L的BrdU溶液加入各孔，于恒温培养箱中培养10 h，将200μl的FixDenant溶液加入，室温下孵育25 min，于2 000 r/min离心10 min，弃上清，将100μl的抗BrdU-POD工作液加入，室温下孵育100 min，于2 000 r/min离心10 min，弃上清，缓冲液反复冲洗3次，弃上清，将100μl的底物溶液加入，室温下孵育25 min，将25μl的H2SO4溶液加入，于400 r/min离心2 min，于20 min内利用酶标仪取450 nm波长对吸光度（A）值进行检测。

1.2.6Western blot检测各组细胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表达取各组传代培养48 h细胞，加入细胞裂解液进行裂解，用总蛋白提取试剂盒对总蛋白进行提取，用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度进行检测。取30μg蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭120 min，分别将小鼠抗大鼠Chemerin单克隆抗体、兔抗鼠细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）单克隆抗体、小鼠抗大鼠p-ERK1/2多克隆抗体、鼠抗JNK单克隆抗体和鼠抗p-JNK单克隆抗体（稀释比例：1∶800、1∶1 200、1∶1 000、1∶500和1∶800）加入，4℃下过夜孵育，用TBST洗涤3次，将二抗加入，室温下孵育60 min，TBST洗涤3次，用ECL发光试剂盒避光反应30 min，利用Image J图像分析软件对获得的条带进行分析，获得各组细胞中 Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK 和 p-JNK蛋白相对表达量。

1.3　统计学方法

利用SPSS21.0软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　小鼠ASMC培养及慢病毒感染检测结果

显微镜下观察，小鼠ASMC呈不规则形、三角形或长梭形，体积较小，见图1A；沉默组和对照序列组小鼠ASMC分别转染Chemerin基因感染序列和阴性对照序列后，培养48 h，荧光显像观察可见绿色荧光达90%以上，见图1B，提示ASMC细胞慢病毒感染成功。

2.2　各组细胞中Chemerin基因表达比较

图1　小鼠ASMC培养及慢病毒感染检测结果

qRT-PCR检测各组细胞中Chemerin表达水平，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=172.943，P=0.000），各组Chemerin表达水平有差异；进一步两两比较显示，与Sham组相比，对照序列组和PDGF组Chemerin mRNA相对表达量均增高（t=31.173和29.351，均P=0.000），Chemerin沉默组Chemerin mRNA相对表达量降低（t=16.817，P=0.000）。与对照序列组和PDGF组相比，Chemerin沉默组Chemerin mRNA相对表达量均降低（t=45.183和42.953，均P=0.000），见图 2。

图2　各组细胞中Chemerin基因表达

2.3　各组细胞增殖能力比较

细胞计数实验显示，Chemerin沉默组、对照序列组、PDGF组和Sham组细胞数分别为（34.27±3.08）×103个 /cm2、（58.62±3.71）×103个 /cm2、（61.35±4.16）×103个 /cm2和（46.14±2.95）×103个 /cm2，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=208.318，P=0.000），各组细胞数有差别；进一步两两比较显示，与Sham组相比，对照序列组和PDGF组细胞数均增加（t=46.826和48.617，均P=0.000），而Chemerin沉默组细胞数降低（t=19.381，P=0.000）；与对照序列组和PDGF组相比，Chemerin沉默组细胞数均降低（t=61.291和 64.064，均P=0.000）。

BrdU掺入法结果显示，Chemerin沉默组、对照序列组、PDGF组和Sham组吸光度A值分别为（1.26±0.07）、（1.58±0.09）、（1.57±0.10）和（1.43±0.08），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=49.164，P=0.000），各组细胞吸光度A值有差别；进一步两两比较显示，与Sham组相比，对照序列组和PDGF组吸光度A值均增加（t=10.517和10.483，均P=0.000），而Chemerin沉默组吸光度A值降低（t=13.067，P=0.000）；与对照序列组和PDGF组相比，Chemerin沉默组吸光度A值均降低（t=16.862和16.798，均P=0.000）。

2.4　各组细胞中 Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表达比较

Western blot检测各组细胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表达水平，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=39.167、48.375、31.272、56.759和 40.391，均P=0.000），各组细胞中 Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK 和 p-JNK蛋白表达水平有差别；进一步两两比较显示，与Sham组相比，对照序列组和PDGF组Chemerin、p-ERK1/2、p-JNK灰度均增高（t=26.842、27.167、20.572、19.883、11.057 和 10.837，均P=0.000），而ERK1/2、JNK灰度均降低（t=29.382、29.168、32.672和32.405，均P=0.000）；与Sham组相比，Chemerin沉默组Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK灰度均降低（t=13.286、12.195、7.235、11.836和10.672，P=0.000、0.000、0.001、0.000 和 0.000）；与对照序列组和PDGF组相比，Chemerin沉默组Chemerin、p-ERK1/2、p-JNK灰度均降低（t=37.268、38.173、11.971、11.684、31.824和 32.174，均P=0.000），而ERK1/2、JNK 灰 度 均 增 加（t=13.082、13.574、13.582和14.015，均P=0.000），见图3和附表。

图3　各组细胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表达

附表　各组细胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表达比较 （±s）

附表　各组细胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表达比较 （±s）

注：1）与Sham组相比，P ＜0.05；2）与PDGF组相比，P ＜0.05；3）与对照序列组相比，P ＜0.05

组别　Chemerin蛋白　ERK1/2蛋白　p-ERK1/2蛋白　JNK蛋白　p-JNK蛋白Sham 组　0.48±0.06　0.63±0.08　0.48±0.09　0.69±0.11　0.54±0.07 PDGF 组　0.69±0.101）　0.36±0.101）　0.62±0.111）　0.40±0.091）　0.66±0.091）对照序列组　0.71±0.121）2）　0.37±0.111）2）　0.64±0.141）2）　0.42±0.121）2）　0.65±0.101）2）Chemerin 沉默组　0.32±0.091）2）3）　0.49±0.091）2）3）　0.39±0.101）2）3）　0.57±0.101）2）3）　0.43±0.081）2）3）F值　39.167　48.375　31.272　56.759　40.391 P值　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000

3　讨论

冠状动脉粥样硬化作为冠心病和冠心病介入治疗术后再狭窄发生的共同病理基础，对患者生命健康造成严重影响[7]。该病发生机制较为复杂，目前尚未完全清楚。Chemerin作为新近发现的脂肪因子，广泛存在于机体组织中，与肥胖相关疾病发生及糖脂代谢失衡密切相关[8]。有研究指出[9]，冠心病患者血浆Chemerin水平升高，且与病情严重程度呈正相关。研究表明[10]，Chemerin与存在于人血管内皮细胞上的特异性CMKLR1结合可诱导血管内皮细胞增殖及血管新生。而血管平滑肌细胞异常增殖在冠状动脉粥样硬化发生及血管重构中发挥关键性作用[11]。亦有研究指出[12]，动脉粥样斑块增殖中Chemerin呈高表达。这些研究表明Chemerin可能参与了动脉粥样硬化发生及进展过程，但具体机制尚不明确。

本研究利用RNA干扰技术，构建Chemerin基因缺陷慢病毒载体，并转染小鼠ASMC，结果显示，小鼠ASMC被成功分离培养，转染培养48 h后，荧光显微镜观察可见绿色荧光达90%以上，提示ASMC细胞慢病毒感染成功。本研究利用PDGF-BB对小鼠ASMC进行诱导，结果显示，PDGF-BB可促进小鼠ASMC增殖。本研究结果显示，Chemerin沉默组细胞中Chemerin基因和蛋白相对表达量均低于对照序列组、PDGF组和Sham组，进一步说明Chemerin沉默组细胞中Chemerin基因被抑制。细胞计数实验和BrdU掺入法结果均显示，Chemerin沉默组细胞数和吸光度A值均降低，表明Chemerin与小鼠ASMC增殖密切相关，抑制Chemerin基因表达可抑制ASMC增殖能力。

研究表明[13]，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在细胞增殖、凋亡、分化、迁移等多种细胞生物学过程中发挥重要作用。MAPK信号活化可促进自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖[14]，阻断MAPK信号通路可抑制动脉损伤后血管平滑肌细胞增殖[15]。ERK1/2和JNK通路是MAPK信号通路中重要组成部分，与细胞增殖、分化和凋亡过程密切相关[16]。本研究显示，Chemerin沉默组细胞中ERK1/2和JNK蛋白相对表达量均高于对照序列组和PDGF组，而低于Sham组，Chemerin沉默组细胞中p-ERK1/2和p-JNK蛋白相对表达量均低于对照序列组、PDGF组和Sham组，而对照序列组和PDGF组均高于Sham组，说明Chemerin沉默组细胞中ERK1/2和JNK信号通路被抑制，提示沉默Chemerin基因阻止小鼠ASMC增殖可能与抑制ERK1/2和JNK信号通路有关。

综上所述，特异性沉默Chemerin基因可阻止ASMC的增殖作用，其机制可能与抑制ERK1/2和JNK信号通路有关，为冠状动脉粥样硬化发病机制研究提供了一定理论基础，同时为该病基因防治提供了潜在靶点。

参 考 文 献：

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