细胞外超氧化物歧化酶DNA甲基化对动脉粥样硬化的诱导作用及作用靶点

陈佳，杨晓龙，张旭峰

（上海中医药大学附属曙光医院1.急诊科，2.重症医学科，3.检验科，上海 201203）

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是导致心肌梗死、心绞痛、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、脑梗死等心脑血管疾病的主要原因[1-3]。目前研究已证实氧化应激诱导血管炎症改变，引起的局部血管炎症反应和细胞过度增殖参与了AS的发生和进展。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是机体抵抗氧自由基损伤的主要防御体系，其中细胞外SOD（extracellular superoxide dismutase，EC-SOD）是唯一在细胞外分布并发挥抗氧化功能的酶[4-6]，也是血管壁抗氧化酶的主要来源。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，参与了AS的发病和局部炎症反应。尽管如此，目前依然无法确定长期持续性血脂异常所诱导的表观遗传改变，特别是EC-SOD甲基化，是否与AS的发病有关。鉴于此，本研究通过复制高脂饮食纯合子载脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E-knockout，ApoE-/-）小鼠模型和THP-1单核细胞源性巨噬细胞，观察EC-SOD甲基化与AS的关系及可能作用靶点，旨在为AS的防治提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　试剂与抗体

RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、二甲基亚砜、胎牛血清、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自广州碧云天生物技术研究所，Trizol试剂、逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，pEGFP-N1-DNMT1重组质粒委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，DNA提取试剂盒、MMLV逆转录酶、dNTP、Taq DNA聚合酶、琼脂糖购自美国Promega公司，THP-1单核细胞株、大肠杆菌DH5α购自上海抚生实业有限公司，基因引物由上海生工公司合成，丙烯酰胺、PVDF膜、十二烷基硫酸钠购自美国Sigma公司。DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）、SOD3抗体、β-actin小鼠单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的羊抗兔子IgG二抗购自美国Santa Cruz公司，丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒均购自上海心语生物科技有限公司。

1.2　动物分组与处理

16只雄性ApoE-/-实验小鼠（ApoE-/-组）和16只C57BL/6小鼠（WT组）购自北京大学实验动物中心[许可证号：SYXK（京）2016-0028]，8周龄，体重18～22 g，标准化饲养房饲养[SPF级动物房，12 h光照与12 h黑暗循环，相对湿度40%～70%，温度（22±2）℃]。普通饲料配方：麸皮25%，玉米25%，豆饼13%，大麦20%，鱼粉6%，其他辅料11%；高脂饲料配方：在普通饲料中加入5%脂肪、1.5%胆固醇、5%蛋黄粉和0.2%胆酸钠。WT组给予不含任何高脂成分的普通饲料喂养，ApoE-/-组给予高脂饲料喂养，小鼠自由摄食和饮水20周后，进行后续实验。

1.3　细胞培养、分组与处理

THP-1单核细胞株接种于RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，光学显微镜下观察细胞形态，当细胞贴壁生长、且出现伪足时，提示已经分化为巨噬细胞。将细胞分为3组：空白对照组（NC组）、空白质粒组（pEGFP-N1组）和重组质粒组（pEGFP-N1-DNMT1组）；取分化为巨噬细胞的THP-1细胞株，NC组用含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基继续培养，pEGFP-N1组加入10μl脂质体Lipofectamine和20μg空质粒载体pEGFP-N1，pEGFP-N1-DNMT1组加入10μl脂质体Lipofectamine和20μg pEGFP-N1-DNMT1重组质粒载体，于37℃、5%CO2下培养，每6 h更换1次培养液，各组细胞继续培养24 h后，进行后续实验。

1.4　动物处理与取样

两组于喂养第8、12、16、20周时，每次每组取4只小鼠，腹腔注射2 ml/100 g麻醉，置于动物手术台上，摘除眼球，取眼眶静脉血3 ml，静置20 min，5 000 r/min离心15 min，吸取上清液，置于-20℃冰箱保存待检。再将小鼠处死，开腹取出主动脉，生理盐水冲洗干净，切取距主动脉弓0.5 cm处的主动脉，分为2部分，一部分采用4%多聚甲醛固定，其余部分于液氮中保存。

1.5　检测指标

1.5.1血脂检测 采用全自动生化分析仪检测小鼠低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、三酰甘油（Triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）等血脂水平，其中LDL、HDL采用常规酶法，TG、TC采用终点法。

1.5.2组织形态学观察取4%多聚甲醛固定的主动脉组织，石蜡包埋，制成4μm的连续切片，采用苏木素-伊红染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察组织形态学特征。

1.5.3氧化应激指标检测取4μg组织样本，匀浆器中打成匀浆，12 000 r/min离心15 min，取上清液待测。采用分光光度比色法检测主动脉组织MDA、ROS含量，所有样本均于酶标仪上检测560 nm处吸光度值，采用标准曲线计算出待测样品蛋白的浓度。

1.5.4RT-PCR检测主动脉组织EC-SOD、DNMT1 mRNA水平液氮中取出主动脉组织，自然解冻，Trizol RNA提取试剂盒提取组织总RNA，紫外分光光度法检测总RNA浓度。将1μg总RNA按照GeneAmp PCR试剂盒说明书逆转录成cDNA；合成体系：逆转录缓冲液3μl，RNA逆转录模板1μl，逆转录酶2μl，正向、反向引物各1μl，加入双蒸水补充至总反应体系为20μl，37℃金属浴反应50 min合成cDNA。将cDNA置于PCR反应体系中进行扩增（引物序列见附表）。PCR反应体系：PCR试剂混合液12.5μl，DEPC 8μl，cDNA 2.5μl，正反向引物 1μl，总反应体系25μl；反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环后72℃ 5 min，溶解曲线条件为55℃～95℃，将PCR产物置于琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，检测基因荧光信号强度值（Ct），计算基因表达量（2-△△Ct），以β-actin作为内参照进行校正，分析目的基因相对表达量。

附表　引物序列及扩增片段长度

1.5.5巢式甲基化特异性PCR检测主动脉组织ECSOD DNA甲基化程度DNA提取试剂盒提取组织总RNA，4%琼脂糖凝胶检测基因组DNA浓度和纯度。PCR反应体系：Power SYBR Green PCR Master Mix10μl，引物 1μl，DNA 模板 2.5μl，ddH2O 15μl。第1轮PCR采用外侧引物，反应条件：95℃预变性5 min，97℃变性30 s，56℃退火30 s，总计35个循环。将第1轮PCR产物稀释50倍，取1μl进行第2轮PCR反应，95℃预变性5 min，97℃变性30 s，62℃退火15 s，总计35个循环。阴性对照为人外周血淋巴细胞，将PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果，甲基化%=甲基化光密度值/（甲基化光密度值+非甲基化光密度值）×100%。

1.5.6Western blot检测EC-SOD、DNMT1蛋白水平和EC-SOD DNA甲基化程度取出对数生长期细胞，弃去培养液，PBS冲洗，加入离心管中，再加入1 ml细胞裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃条件下离心15 min，采用Western blot检测EC-SOD、DNMT1蛋白水平，将20μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE电泳分离，常规湿法转膜，加入5%脱脂牛奶孵育封闭2 h。加入鼠抗人EC-SOD单克隆抗体、兔抗人DNMT1单克隆抗体，4℃孵育24 h。再滴加FITC标记的二抗37℃孵育2 h。PBS冲洗3次，按照ECL化学发光显影试剂盒显影，以β-actin作为内参照，分析目的条带相对表达量。各组细胞EC-SOD DNA甲基化程度方法同上。

1.6　统计学方法

采用SPSS19.0软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　血脂水平变化

第 8、12、16、20周，ApoE-/-组 TC（见图 1A）、LDL（见图1B）、TG（见图1C）呈升高趋势（F=3.140、4.183 和 4.920，P=0.041、0.033 和 0.029），HDL（见图1D）无明显变化（F=0.735，P=0.955）；各时段ApoE-/-组TC、LDL、TG高于WT组，HDL低于WT组（P＜0.05）。

图1　两组血脂比较

2.2　主动脉病理形态变化

第16、20周，WT组动脉组织内皮细胞结构规则有序，平滑肌细胞排列整齐，内皮下无炎症细胞或脂质沉积；ApoE-/-组主动脉内膜明显增厚，血管壁伴有弥漫性隆起，平滑肌细胞排列无序，内皮下伴有炎症浸润和脂质沉积。见图2。

2.3　氧化应激指标变化

第 8、12、16、20周，ApoE-/-组MDA（见图 3A）、ROS（见图3B）呈升高趋势（F=8.143和9.224，P=0.021和0.019），各时段ApoE-/-组MDA、ROS高于 WT 组（P＜0.05）。

2.4　EC-SOD、DNMT1 mRNA及 EC-SOD甲基化水平变化

第 8、12、16、20 周，ApoE-/-组 EC-SOD mRNA（见图4A）表达水平低于WT组（F=17.320，P=0.000），DNMT1 mRNA表达水平（见图4B）和EC-SOD甲基化水平（见图4C）高于WT组（F=16.477和4.965，P=0.001和 0.024）。

2.5　pEGFP-N1-DNMT1转 染 后EC-SOD、DNMT1蛋白及EC-SOD甲基化水平变化

pEGFP-N1-DNMT1组DNMT1蛋白表达（见图5A）及EC-SOD甲基化水平（见图5C）高于pEGFPN1组（F=7.884和6.329，P=0.028和0.037）和NC组（F=7.955和6.059，P=0.004和0.019），EC-SOD蛋白表达水平（见图5B）低于pEGFP-N1组（F=15.365，P=0.000）和NC 组（F=6.331，P=0.037），pEGFP-N1组和NC组EC-SOD、DNMT1蛋白表达水平及ECSOD甲基化水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2　两组主动脉病理形态变化

图3　两组氧化应激指标比较

图5　pEGFP-N1-DNMT1转染后EC-SOD、DNMT1蛋白表达及EC-SOD甲基化水平比较

3　讨论

正常情况下，机体处于氧化和抗氧化动态平衡，当平衡被打破后就会导致氧自由基生成、清除失衡，引起ROS蓄积，最终引起氧化应激损伤[7-9]。目前已证实氧化应激损伤与AS的发生和进展密切相关，氧化应激能通过诱导氧化作用，引起局部炎症反应和细胞增殖，因此针对性的抗氧化治疗成为AS防治的主要手段。ApoE-/-实验小鼠是复制AS模型常用的动物，本研究利用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠，结果显示ApoE-/-组TC、LDL、TG高于WT组，HDL低于WT组；主动脉根部切片染色显示ApoE-/-组主动脉内膜明显增厚，WT组动脉组织内皮细胞结构规则有序，证实AS小鼠模型复制成功。进一步分析两组小鼠的氧化应激指标，结果显示ApoE-/-组MDA、ROS呈升高趋势，各时段ApoE-/-组MDA、ROS高于WT组，说明AS与氧化应激损伤密切相关。NOMIYA等[10]报道称氧化应激能损伤血管内皮细胞，进而诱发粥样斑块形成和脂质沉积，这一过程亦是AS的始动因素。PEREIRA等[11]也证实高脂喂养的ApoE-/-小鼠血脂异常升高，ROS水平增加，证实高脂血症也会诱导氧化应激反应。

机体发生氧化应激时，能够启动自身的抗氧化防御体系，其中EC-SOD唯一分布于细胞外的抗氧化酶，其通过与硫酸乙酰肝素结合，将氧自由基歧化为H2O2，保护组织避免发生自由基损伤，预防AS发生[12-13]。最新研究发现[14]，EC-SOD还具有调节内源性NO的作用，所产生的NO能够扩张血管平滑肌、抑制血小板聚集，进而抑制AS发生和进展。本研究发现ApoE-/-组EC-SOD mRNA表达水平低于WT组，说明EC-SOD含量偏低引起的抗氧化防御体系功能减弱是导致AS的诱因之一。TEOH-FITZGERALD等[15]报道称细胞外高浓度EC-SOD能够有效清除氧自由基，减少超氧化亚硝基阴离子形成，进而保护细胞避免氧自由基损害，抑制AS的进程。BREAK等[16]也证实EC-SOD能够抑制还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和ROS增多而产生的氧自由基，将小鼠EC-SOD基因敲除后，小鼠发生AS的风险升高。

目前已经明确EC-SOD是抗氧化的主要酶系，但是其在粥样硬化过程中的作用机制仍存在一定争议。随着分子生物学的研究深入，人们逐渐认识到表观遗传在心血管疾病发病中的作用。作为表观遗传的典型标记，DNA甲基化在多种生物学功能中发挥着重要作用[17-18]。杨程等[19]对40例确诊为AS的患者外周血基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）进行检测，结果发现AS患者外周血TIMP-1含量低于正常对照组，进一步发现其降低的机制与TIMP-1基因启动子区的高甲基化密切相关，提示基因DNA甲基化也是导致AS形成的原因之一。本研究ApoE-/-组EC-SOD甲基化水平高于WT组，说明AS发病可能与EC-SOD甲基化水平增加，进而导致EC-SOD表达下调有关。DNMT1是维持基因DNA甲基化修饰状态的主要酶系，也是调节基因DNA甲基化水平的关键[20]；DNMT1表达与DNA甲基化程度正相关，与基因表达负相关[21]。本研究证实ApoE-/-组DNMT1表达水平高于WT组，成功转染DNMT1的巨噬细胞DNMT1蛋白表达及EC-SOD甲基化升高，EC-SOD蛋白表达降低，说明DNMT1催化EC-SOD转甲基反应，导致EC-SOD水平降低，进而加重氧化应激损伤，最终形成AS。这一结果也提示DNMT1可以作为AS靶向治疗的1个潜在作用靶点。

综上所述，EC-SOD甲基化程度升高，导致ECSOD表达降低，机体抵抗氧化应激反应能力减弱，最终发展成AS。

参 考 文 献：

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