α-硫辛酸对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其可能的机制*

张小欢 ，毛彦稳 ，彭伟 ，王圆圆 ，刘丽荣 ，刘玲伶 ，石明隽，肖瑛，汤磊，郭兵

（1.贵州医科大学 病理生理学教研室，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学 重大疾病发病机制及药物防治特色重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州医科大学附属医院检验科，贵州 贵阳 550004；4.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550004）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常见的严重微血管并发症之一，DN晚期的主要病理特征包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化。而氧化应激（oxidative stress，OS）在DN的发病过程中发挥着重要作用[1]。在正常生理状态下，适量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）能迅速被肾组织内抗氧化物质（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等）清除；在糖尿病或高血糖环境时，ROS产生增多而清除减少，体内聚集大量的ROS便可诱导肾脏固有细胞发生氧化应激，产生大量过氧化代谢产物（如丙二醛等）；并且可以诱导胞内相关信号通路的激活，经核内转录因子介导促纤维化生长因子（如转化生长因子、结缔组织生长因子等）基因转录和高表达，最终出现细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积而形成肾脏纤维化[2-3]。而转化生长因子（transforming growth factor β1，TGF-β1）信号通路是目前公认的与糖尿病肾脏纤维化密切相关的信号通路，主要通过诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞转化（epithelial mesenchy-mal transition，EMT），促使ECM合成增加并抑制其降解而过度沉积，从而造成广泛的肾脏纤维化[4]。而核转录共抑制因子（Skirelated novel protein，SnoN）是 TGF-β1信号通路的负性调控因子，可以通过抑制TGF-β1信号通路来延缓肾脏纤维化进程。研究表明[5]，α-硫辛酸（alpha lipoic acid，ALA）是一种含硫的抗氧化剂，可以清除活性氧和自由基，对氧化应激引起的组织损伤有治疗作用。因此，本研究旨在观察抗氧化剂ALA对DM大鼠肾脏的保护作用，并探讨其是否通过调节SnoN表达和TGF-β1信号通路来发挥对肾脏的保护作用，以进一步了解ALA的作用机制，为DN的防治提理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验动物健康清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠，体重（180±20）g，共24只；由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，批号为SCXK（京）2009-0004。

1.1.2主要试剂ALA（中国奥立宝公司），链脲菌素（Streptozotocin，STZ；美国Sigma公司），总抗氧化物酶活性（total antioxidant capacity，T-AOC）、总超氧化物歧化酶活性（total superoxide dismutase，T-SOD）、过氧化氢酶活性（Catalase，CAT）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成公司），SnoN、TGF-β1多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），Collagen I和Collagen IV单克隆抗体（美国Sigma公司），β-actin抗体（中国Boster公司），两步法免疫组织化学检测试剂盒、3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole，AEC）（中杉金桥生物技术有限公司），I抗稀释液，超敏显色液（enhanced chemiluminescent，ECL）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），Western blot用PVDF膜和3 mm Whatman滤纸（美国Millipore公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.1.3主要器材稳步倍加型血糖仪（美国强生公司），超低温冰箱（日本Sanyo公司），高速低温离心机（美国Beckman公司），Bayer1650全自动生化分析仪（美国Beckman公司），电泳系统及电转移装置（瑞典Amersham公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2　方法

1.2.1动物模型复制及分组SD大鼠适应性喂养一周后，尾静脉注射溶于0.01 mol/L（pH=4.5）无菌柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液的STZ（55 mg/kg）复制DM大鼠模型，72 h后测大鼠空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖阳性认为复制成功，随后随机分成糖尿病组（DM组，n =8）、硫辛酸治疗组（ALA 组，n =8）。成模 2周后，采取灌胃方式给予硫辛酸治疗，硫辛酸溶于5%的羧甲基纤维素钠（car-boxy methylated cellulose，CMC）中，灌胃剂量为150 mg/（kg·d），每周给药6 d，3 d配一次药（4℃保存）；并设鼠龄相同的正常对照组（NC组，n =8），灌胃同等浓度同等剂量的CMC；6周后处死所有SD大鼠，期间所有大鼠予标准饲料喂养，自由饮水，每周监测1次血糖和体重。

1.2.2标本收集大鼠处死前1 d用代谢笼收集24 h尿，记录尿量，取部分尿液离心后-20℃保存；处死前禁食6～8 h，乙醚麻醉后称重，股动脉穿刺采血，分离血清-20℃保存；开腹取双侧肾脏，去掉包膜及周围脂肪组织，称重记录肾重/体重（kidney weight/body weight，KW/BW），分别用4%多聚甲醛固定及-80℃保存。

1.2.3生化指标测定葡萄糖氧化酶法测血清葡萄糖（blood glucose，BG），酶分析法检测血总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（Triglyceride，TG），邻苯三酚红比色法测尿蛋白（urine protein，UP），均按试剂盒说明书操作，尿蛋白浓度与尿量乘积为24 h UP。

1.2.4氧化应激水平检测每个肾组织标本均称取0.2 g按1∶9的比例与0.9%的生理盐水混合，置于匀浆器中冰上匀浆组织制成10%的组织匀浆，再用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定组织匀浆的蛋白浓度。最后参照试剂盒说明书进行T-AOC、MDA、CAT和T-SOD的检测。其中，检测T-AOC和MDA时直接使用10%的组织匀浆；而检测CAT时将样本在10%的组织匀浆的基础上用生理盐水作40倍稀释，检测T-SOD时将样本作100倍稀释。4项指标的检测均采用比色法。

1.2.5肾组织病理检查多聚甲醛固定肾组织，制成3μm厚的石蜡切片，行HE及Masson染色，光镜观察肾组织形态结构变化。

1.2.6免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用SP两步法检测Collagen I在各组大鼠肾组织的分布和表达，石蜡切片脱蜡水化，经3%的过氧化氢去离子水孵育及胰酶修复后，Collagen I（1∶100），4℃孵育过夜加入生物素化二抗，室温下孵育30 min，AEC显色，阳性染色为红色，苏木素复染，PBS代替一抗，作为阴性对照。

1.2.7Western blot检测取-80℃保存的各组大鼠肾皮质，每只样本取200 mg，分别加入组织蛋白提取液后匀浆离心取上清，用BCA试剂盒测定各组蛋白质浓度，按所测得浓度计算每泳道所需体积，加入加样缓冲液煮沸10 min，经8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入 β-actin、SnoN、TGF-β1、Collagen Ⅳ一抗，工作浓度分别为1∶4 000、1∶300、1∶300、1∶1 000，4℃孵育12～24 h；次日，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（浓度均为1∶4 000）室温孵育1 h，加ECL荧光显色液，凝胶成像仪曝光，Image Lab软件分析各条带调整体积值，每个样本重复操作3次，以β-actin蛋白条带作为内参，结果用目标蛋白与β-actin的比值来表示。

1.3　统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，若数据符合正态分布，通过方差齐性检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　生化指标检测结果

大鼠在注射STZ 72 h后，BG升高并持续在高水平，且尿糖阳性。实验6周后，3组KW/BW、BG、24 h UP、TC和TG比较，采用单因素方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05），DM组的KW/BW、BG、24 h UP、TC和TG与NC组相比均升高（P ＜0.05）；与DM组相比，ALA组KW/BW、24 h UP、TC和TG均降低（P ＜0.05），而BG增高，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表 1。

2.2　氧化应激水平检测结果

实验6周后，3组大鼠肾组织中T-AOC、MDA、T-SOD和CAT比较，采用单因素方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）；DM组T-AOC、T-SOD和CAT与NC组相比降低，使用ALA治疗后，ALA组T-AOC、T-SOD和CAT活性较DM组增高（P ＜0.05）；而DM组MDA含量较NC组升高（P ＜0.05），ALA能降低DM大鼠肾组织MDA含量。见表2。

2.3　肾组织病理改变

HE及Masson染色可见正常大鼠肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整，间质未见炎症细胞浸润；DM组大鼠肾小管腔扩张明显，肾小管基底膜不规则增厚，肾小管上皮细胞出现空泡状改变，间质出现炎症细胞浸润，肾小管间质Masson染色阳性物质增多；ALA组大鼠肾脏病变有不同程度的改善，肾小管间质Masson染色阳性物质减少，炎症细胞浸润减轻，空泡状改变不明显（见图1、2）。

2.4　免疫组织化学结果

免疫组织化学染色检测Collagen I的表达，NC组大鼠肾组织Collagen I阳性染色主要存在血管周围和细胞间质，而DM组大鼠阳性染色增多，可见肾小管基底膜强阳性染色，ALA治疗后 Collagen I的表达减少。见图3。

表1　各组大鼠KW/BW、BG、24 h UP、TC、TG的变化 （n =8，±s）

表1　各组大鼠KW/BW、BG、24 h UP、TC、TG的变化 （n =8，±s）

注：1）与NC组相比，P ＜0.05；2）与DM组相比，P ＜0.05

组别　KW/BW/（mg/g）　BG/（mmol/L）　24 h UP/mg　TC/（mmol/L）　TG/（mmol/L）NC 组　7.28±0.65　5.88±1.05　3.13±0.54　1.41±0.22　1.42±0.38 DM组　12.15±1.571）　25.92±1.861）　20.65±1.051）　2.34±0.301）　2.41±0.591）ALA 组　10.58±0.581）2）　26.60±1.691）　16.12±0.711）2）　1.56±0.332）　1.37±0.452）F值　66.573　119.112　27.566　25.716　13.731 P值　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000

表2　各组大鼠氧化应激水平的比较 （n =8，±s）

表2　各组大鼠氧化应激水平的比较 （n =8，±s）

注：1）与NC组相比，P ＜0.05；2）与DM组相比，P ＜0.05

NC 组　0.67±0.02　2.06±0.09　688.53±49.76　44.60±4.50 DM组　0.32±0.011）　2.62±0.091）　433.41±37.111）　24.36±2.491）ALA 组　0.56±0.061）2）　2.19±0.081）2）　640.99±27.522）　44.30±3.572）F值　131.181　72.075　68.405　70.539

2.5　Western blot结果

Western blot检测各组SnoN、TGF-β1和CollagenⅣ蛋白表达的水平，NC组中，SnoN条带较粗较强，而TGF-β1和CollagenⅣ条带较细较弱。与NC组相比，DM组中SnoN条带灰度值较少，TGF-β1和CollagenⅣ条带灰度值增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与DM组相比，ALA组SnoN条带变粗变强，TGF-β1和Collagen Ⅳ条带变细变弱，均差异有统计学意义（P ＜0.05），见图 4。

图2　各组大鼠肾组织形态 （Masson染色）

图3　各组大鼠肾组织Collagen I蛋白表达 （免疫组织化学染色）

图4　各组大鼠肾组织中SnoN、TGF-β1和Collagen Ⅳ蛋白表达水平比较

3　讨论

氧化应激被认为是造成糖尿病及其并发症的重要原因之一[6-7]。ROS产生和清除之间的平衡决定了机体内氧化应激水平，ROS产生过多和/或抗氧化系统酶活性的降低可导致体内氧化应激水平增加。OS可以诱导肾脏发生损伤，主要表现为肾小球和肾小管固有细胞结构和功能上的改变[3]。有研究表明[8-9]，肾脏中过多的OS可以破坏足细胞结构，使肾小球足细胞足突肥大；过多的ROS持续刺激还将诱导肾小管炎症反应和肾间质纤维化的形成。本研究复制DM大鼠模型6周后发现，DM大鼠肾组织脂质过氧化产物MDA含量升高而抗氧化物质T-AOC、T-SOD及CAT活性水平降低，且伴有明显的肾脏病理学改变，表明糖尿病时其氧化程度加重，抗氧化能力下降。而ALA作为一种抗氧化剂，可与其他抗氧化剂共同作用，抑制脂质过氧化[5，10]。本实验在DM大鼠模型复制2周后给予ALA治疗发现，ALA组血糖虽然没有明显变化，但病理学及生物化学检查显示ALA组肾脏病变程度减轻，同时在给予ALA治疗后大鼠肾脏脂质过氧化程度减轻，抗氧化能力增强。表明ALA可以降低DM大鼠肾脏的氧化应激水平，改善DM大鼠肾功能和代谢。

有研究表明[11]，在糖尿病或高血糖状态下，肾脏内过多的ROS可激活胞内多条信号通路，包括MAPK通路、ERK通路等。还有研究表明[12]，肾小管/间质内过多产生的ROS诱导TGF-β1等致纤维化因子大量释放和表达，促使肾间质纤维化的发生。说明肾脏内过多的ROS可能也诱导了TGF-β1信号通路的激活，从而加重其对肾脏的损害。而肾纤维化是DN终末期病理特征之一，有许多细胞因子参与这个过程，TGF-β1是目前公认最重要的致纤维化因子之一，主要通过介导TGF-β1信号通路来发挥其致纤维化效应[13-14]。SnoN作为TGF-β1信号通路的负调控因子，在肾脏纤维化过程发挥重要作用，它可以抑制TGF-β1信号通路的激活，并能抑制ECM沉积，从而达到延缓肾纤维化进程的目的[15-16]。本研究提示，DM组SnoN蛋白表达较NC组减少，TGF-β1水平与NC组比增高，并且伴随着Collagen I、Collagen Ⅳ的大量沉积；而用ALA治疗干预后，SnoN蛋白表达增多，TGF-β1蛋白表达和胶原沉积水平均下降。实验6周后，大鼠肾组织ROS产生增多，脂质过氧化程度加深，抗氧化能力减弱，促进TGF-β1高表达而抑制SnoN蛋白表达，导致SnoN调控TGF-β1信号通路的平衡被破坏，TGF-β1通过其下游胞内信号转导，促进目的基因Collagen I、Collagen Ⅳ的转录和翻译增多，致使Collagen I、Collagen Ⅳ在肾间质的沉积增多，DN发生纤维化病变；而用抗氧化剂ALA干预后DM大鼠肾脏脂质过氧化程度减轻，抗氧化能力增强，恢复SnoN蛋白水平并抑制TGF-β1表达，使两者之间的关系重新得到平衡，进而发挥延缓和治疗DN的作用。

综上所述，ALA减少了DM大鼠肾脏ROS的产生和脂质损伤，进而上调SnoN蛋白的表达、阻止TGF-β1信号通路的转导，从而发挥其延缓或阻断肾脏纤维化发生发展的作用，对DM大鼠肾脏起到保护作用。

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