B细胞连接蛋白在原核细胞中的表达和纯化

张志英，肖斌，蒋娟，黄秀娜，张蓉，李晓，刘娟子，连菲，杨永泉，张莹莹，孙朝晖，李林海

中国人民解放军广州总医院，广东 广州 510010

B细胞连接蛋白（B-cell linker，BLNK；或称SLP-65、BASH或BCA）是一种接头蛋白，主要表达于B细胞和巨噬细胞中，能够向其下游的分子传递磷酸化信号，进而参与B细胞受体（B cell receptor，BCR）的信号转导过程[1]。1998年日本学者发现并定义了人体内的BLNK蛋白[2]。

当BCR发生偶联后，ITAM基序与脾酪氨酸激酶（Syk）结合使Syk发生酪氨酸磷酸化，磷酸化的Syk与BLNK结合使BLNK发生酪氨酸磷酸化，磷酸化的BLNK可以招募下游的多个效应蛋白，包括Grb2、Sos、PLCγ和Nck，进而PLC-γ2、Ras和Rac1-JNK信号通路得到活化[3-5]。BLNK在整个B细胞的发育过程中发挥巨大作用，在一些癌症尤其是前体B细胞白血病的治愈过程中的作用更明显[6]。在此，我们构建了pMAL-c5x-BLNK重组质粒并表达纯化了BLNK蛋白，为后续探讨BLNK蛋白的相互作用蛋白和分子结构打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌BL21（Plyss）（本实验室保种）、TOP10感受态细胞［天根生化（北京）有限公司］；pMAL-c5x质粒（钟鼎生物公司）；质粒小抽试剂盒（Biotool公司）；蛋白marker（Thermo公司）；IPTG、Acr、Bis、Tris（Sigma公司）；SDS（Amresco公司）；TEMED（Bio-Rad公司）；限制性内切酶（Ta⁃KaRa公司）；PfuDNA聚合酶（Zoonbio公司）；胰蛋白胨、酵母抽提物（Oxoid公司）；琼脂糖（上海基因公司）；DNA胶纯化试剂盒（Axygen公司）。

1.2 基因扩增和pMAL-c5x-BLNK质粒构建

提取293T细胞的RNA，逆转录为cDNA，通过PCR扩增获取BLNK全长基因。PCR反应体系：模板DNA 2.0 μL，引物F 11.0 μL，引物R 11.0 μL，10×缓冲液5.0 μL，dNTP混合液4.0 μL，PfuDNA聚合酶1.0 μL，蒸馏水加至50 μL。扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。扩增完毕，产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化特异性的单一扩增条带。将纯化的目的基因和原核表达质粒分别经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，并用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10克隆菌株，重组质粒经PCR和双酶切筛选阳性克隆，送华大基因公司测序，验证无误后用于后续实验。将重组质粒命名为pMAL-c5x-BLNK（图1）。

图1 pMAL-c5x质粒模式图

1.3 诱导表达和鉴定

将1 μL重组质粒pMAL-c5x-BLNK加入100 μL感受态大肠杆菌BL21（Plyss）中，置冰上20 min；42℃热激90 s，迅速置冰中5 min；加入600 μL LB培养液，37℃、220 r/min振摇1 h；离心后全部涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜。

IPTG诱导BLNK融合蛋白的表达。挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL氨苄青霉素的3 mL LB培养液试管中，37℃、220 r/min振摇过夜；次日按1∶100接种于含50 μg/mL氨苄青霉素的30 mL LB培养液中，37℃、220 r/min振摇至菌液D600nm为0.6～0.8（约2 h）；取1 mL培养物，室温下10 000 r/min离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，11℃、220 r/min振摇过夜，诱导融合蛋白表达；取出1 mL培养物，室温下10 000 r/min离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000 r/min离心10 min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液经超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬，进行12%SDSPAGE，考马斯亮蓝染色显带。

1.4 融合蛋白的MBP柱亲和纯化

利用低压层析系统，溶液以0.5 mL/min流速上样至MBP结合缓冲液预平衡的Amylose亲和层析柱；用MBP结合缓冲液以0.5 mL/min的流速冲洗，至流出液D280nm值到达基线；用MBP洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L麦芽糖，0.15 mol/L NaCl，pH8.0）以1 mL/min的流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，用20 mmol/L Tris-HCl、0.10 mol/L NaCl（pH8.0）透析过夜，进行12%SDS-PAGE分析。

2 结果

2.1 BLNK基因扩增和pMAL-c5x-BLNK质粒构建

提取293T细胞RNA逆转录为DNA，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果（图2A）显示扩增出1条特异性条带，大小介于1000与1500 bp之间，与理论值1369 bp相符。对该特异性条带进行割胶纯化，纯化的目的基因和原核表达质粒分别经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂板、挑单克隆、过夜培养后提取质粒，重组质粒被AsiSⅠ和MluⅠ双酶切成线性化载体（大片段）及插入基因（小片段）两部分（图2B）。华大基因公司测序证实插入基因序列正确，无突变、缺失，表明pMAL-c5x-BLNK原核表达质粒构建成功。

2.2 诱导表达和鉴定

将pMAL-c5x-BLNK重组质粒转化大肠杆菌BL21（Plyss），IPTG浓度为0.5 mmol/L，于11℃、220 r/min振摇过夜，诱导融合蛋白表达。重悬液经超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬，进行12%SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色显带，结果如图3，在相对分子质量约116×103处有较浓的特征蛋白条带出现，与预期大小一致，而对照组无此条带，说明重组菌能表达BLNK蛋白。沉淀液在相应位置没有条带，说明BLNK蛋白主要在菌液上清中。

2.3 融合蛋白的MBP柱亲和纯化

图2 BLNK基因的扩增（A）及pMAL-c5x-BLNK重组质粒的酶切鉴定（B）M：DNA marker；1：阴性对照；2，3：基因扩增产物；4：酶切前；5：酶切后

图3 重组菌的诱导表达M：蛋白marker；1：未诱导；2：诱导后的菌液；3：诱导后的菌液上清；4：诱导后的菌液沉淀

表达菌株经诱导表达后，通过MBP柱亲和纯化并进行12%SDS-PAGE分析，在相对分子质量约116×103处可见蛋白带（图4），无杂带，与目标条带相符，表明制备了纯度较高的BLNK蛋白。

图4 BLKN蛋白亲和纯化的SDS-PAGE分析M：蛋白marker；1：未纯化；2：流出液；3：洗脱液

3 讨论

BLNK是B细胞特异性的连接蛋白，当抗原与BCR结合后活化下游的Syk，活化的Syk磷酸化BLNK，磷酸化BLNK为众多免疫调节分子提供结合位点，并与招募的B细胞信号分子结合，从而调节MAP3K、JNK及NF-κB等信号通路，对B细胞的发育和功能起关键性作用[7-10]。BLNK在整个B细胞的发育过程发挥巨大作用，在一些癌症尤其是前体B细胞白血病的治愈过程中发挥着巨大的作用。前体B细胞急性淋巴细胞白血病是儿童常见白血病，研究表明50%的患者都是因为体内缺少BLNK表达所造成的，因此BLNK在人体中是一种重要的肿瘤抑制因子[11-17]。

我们将pMAL-c5x-BLNK重组质粒转化大肠杆菌BL21（Plyss）后优化表达条件，将表达温度分别调整至11、15、18、25、37℃，目标蛋白均可以表达，但表达效果略有差异。经过多次优化，最终结果表明转化BL21（Plyss）后IPTG浓度0.5 mmol/ L、温度11℃时表达效果最好，条带清晰无杂带。

综上，我们构建了B细胞连接蛋白的原核表达质粒pMAL-c5x-BLNK，并获得了高纯度的B细胞连接蛋白，为后续研究BLNK蛋白的相互作用蛋白和分子结构打下了基础。

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