Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究

李达，沈雪莲，李少华，丁红梅，李慧，黄皑雪，耿介，王超男，白琛俊，张坦，董洁，邵宁生

军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850

Ku蛋白是一种含量丰富的核蛋白，进化上高度保守，分布广泛，从细菌到人类均有表达[1-2]。人Ku蛋白是异二聚体，由Ku70和Ku80两个亚基组成。研究发现，Ku蛋白具有不同寻常的DNA结合特性，其以非序列依赖性的方式紧密结合在双链DNA的断端，是经典非同源末端连接（classi⁃cal non-homologous end joining，C-NHEJ）途径中的DNA末端结合因子，招募DNA依赖的蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）与其结合形成DNA依赖的蛋白激酶全酶，催化双链断裂DNA的修复[2-7]。

此外，Ku蛋白还可能参与其他重要的生物学过程，比如Ku蛋白被证实与染色体端粒结构的维持有密切联系。研究发现在失去任意一个Ku蛋白亚基后，酿酒酵母就会出现端粒结构缺失的现象[8-9]。还有研究显示Ku70与细胞凋亡有直接联系，即Ku70能够与促凋亡因子Bax结合，抑制其促进细胞凋亡的作用[10]。然而，Ku蛋白的生物学功能尚未得到完全阐释，有待深入研究。

我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏HeLa细胞Ku70基因开放读框，同时在其中插入潮霉素B抗性基因，然后通过潮霉素B抗性筛选获得Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株，再进一步利用此细胞株研究Ku70蛋白的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料

HeLa细胞由本实验室保存；pCas-guide和pSilencer2.1-U6hygro质粒由军事医学研究院郑晓飞教授惠赠；感受态大肠杆菌DH5α、T4DNA连接酶、细胞基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；PCR平末端产物加A试剂盒、pBackZero-T载体为TaKaRa公司产品；pfuDNA聚合酶购自北京全式金生物技术公司；限制性核酸内切酶BamHⅠ、BsmBⅠ为Thermo Scientific公司产品；PRIME jet转染试剂为PolyPlus公司产品；潮霉素B为Roche公司产品；Ku70抗体购自Pro⁃teintech公司；GAPDH抗体购自中杉金桥公司；CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；2×SYBR Green Mix购自Toyobo公司；引物由生工生物技术公司合成。

1.2 构建pCas-gRNA质粒

用CRISPR DESIGN程序设计针对人Ku70基因的向导RNA（guide RNA，gRNA）序列（表1），合成编码gRNA的DNA序列，退火形成双链DNA。用限制性内切酶BamHⅠ、BsmBⅠ对pCas-guide载体和退火产物进行双酶切，胶回收酶切产物。将酶切后的pCas-guide载体和退火产物用T4DNA连接酶于20℃连接4 h，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于氨苄西林（Amp）抗性的细菌培养板上，37℃培养过夜。挑取细菌单克隆，菌液PCR鉴定后选取阳性克隆测序。

表1 合成的引物序列

1.3 构建供体DNA质粒pBackZero-T-Ku70

以HeLa细胞基因组为模板，Ku70-F1/Ku70-R1为引物扩增Ku70左同源臂片段Ku70-L，以Ku70-F2/Ku70-R2为引物扩增Ku70右同源臂片段Ku70-R；以pSilencer2.1-U6hygro质粒为模板，Hy-F/Hy-R为引物扩增潮霉素B抗性基因片段Hy；琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收片段Ku70-L、Ku70-R和Hy。以片段Ku70-L、Hy为模板，Ku70-F1/Hy-R为引物，重叠PCR扩增出Ku70-LHy；再以Ku70-L-Hy和Ku70-R为模板，Ku70-F1/ Ku70-R2为引物，扩增获得片段Ku70-KO，回收目的片段。用A-Tailing Kit在Ku70-KO片段平末端添加单个碱基A后，将该片段连接到pBackZero-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α并挑取单克隆菌株进行菌液PCR鉴定，选取阳性克隆测序。

1.4 细胞转染、抗性筛选与鉴定

将HeLa细胞以3×105/mL的密度接种于6孔细胞培养板中，细胞生长至30%～40%时转染0.8 μg pCas-gRNA质粒和1.2 μg pBackZero-T-Ku70质粒，转染后72 h收集细胞，以4×104/mL的密度接种至6孔板中，待细胞完全贴壁后加入潮霉素B（200 μg/mL），2～3 d更换一次含同浓度潮霉素B的新鲜培养基，培养至第7 d提取细胞基因组做PCR鉴定。以提取的细胞基因组为模板，Ku70左同源臂基因上的引物K-F和潮霉素B抗性基因上的引物K-R进行PCR扩增。之后将细胞扩大培养，冻存。

1.5 单克隆稳定细胞株筛选与鉴定

用有限稀释法筛选Ku70稳定敲除的HeLa单克隆细胞株，胰酶消化细胞，以新鲜培养基稀释细胞浓度至10/mL，将稀释的细胞悬液接种至96孔板，100 μL/孔，培养1周后显微镜下观察，选取含单克隆细胞的孔进行扩大培养。扩大培养至24孔板时改用含200 μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，1周后收集细胞进行Western印迹鉴定。

1.6 Western免疫印迹实验

收集细胞，用RIPA提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量，行12%SDS-PAGE，每泳道35 μg蛋白，然后湿转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；一抗室温孵育2 h，0.1%TBS-T洗3次；二抗室温孵育1 h，0.1%TBS-T洗3次；ECL曝光显影。

1.7 CCK-8法测定Ku70稳定敲除细胞株的增殖能力

将处于对数生长期的Ku70稳定敲除细胞和野生型HeLa细胞以3×104/mL的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，分别在0、24、48、72、96 h加入CCK8试剂，每孔10 μL，继续培养1 h后检测D450nm值，制作细胞的96 h生长曲线。

1.8 Transwell方法检测Ku70稳定敲除细胞株的迁移能力

将处于对数生长期的Ku70稳定敲除细胞和野生型HeLa细胞以2×105/mL的密度种于Tran⁃swell小室的上室，下室加入500 μL完全培养基，培养12 h后擦去未穿膜的细胞，用4%多聚甲醛固定穿膜细胞，0.1%结晶紫染色后在显微镜下观察并拍照。

1.9 Ku70稳定敲除细胞的miRNA表达水平检测

用TRIzol法提取Ku70稳定敲除细胞和野生型HeLa细胞的总RNA，取1 μg RNA反转录为cDNA。qPCR反应体系包括1 μL cDNA、1 μL引物（表1）、10 μL 2×qPCR SYBR Green mix、8 μL ddH2O。反应条件：预变性95℃ 10 min，变性95℃ 20 s，退火55℃ 20 s，延伸72℃ 20 s，50个循环，采集熔解曲线。用 StrataGene公司的Mx3000P qPCR仪检测，Mx3000P软件分析结果。

1.10 统计分析

所有实验均重复3次以上，数据以x±s表示，统计分析使用SAS 9.2软件的Student'sttest，P＜0.05视为具有统计学差异。

2 结果

2.1 设计并构建pCas-gRNA质粒

用 CRISPR DESIGN程 序（http://crispr.mit. edu/）设计gRNA序列。选取Ku70编码区100～300 bp序列输入对话框，从输出的结果中选择合适的靶位点序列。为了防止脱靶，我们共设计了3条gRNA序列。将合成的gRNA互补链退火形成双链，与双酶切的线性化pCas-guide连接，获得重组质粒pCas-gRNA。转化铺板后挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，将阳性克隆测序（图1），结果显示3条gRNA序列均正确插入pCas-guide载体，pCasgRNA质粒构建成功。

图1 pCas-gRNA质粒菌液PCR鉴定M：DNA marker；1～10：单克隆

2.2 构建供体DNA质粒pBackZero-T-Ku70

以HeLa细胞基因组为模板，分别以Ku70-F1/ Ku70-R1、Ku70-F2/Ku70-R2为引物，扩增长度分别为500和540 bp的Ku70左右同源臂Ku70-L、Ku70-R；以质粒pSilence2.1-U6 hygro为模板，Hy-F/Hy-R为引物，扩增长度为1026 bp的潮霉素抗性基因片段Hy；进而，以DNA片段Ku70-L、Hy为模板，Ku70-F1和Hy-R为引物，利用搭桥PCR扩增片段Ku70-L-Hy；再以Ku70-L-Hy和Ku70-R为模板，Ku70-F1和Ku70-R2为引物，扩增获得2066 bp的Ku70同源臂供体DNA片段Ku70-KO。琼脂糖凝胶切胶回收PCR产物中的目的片段，在其末端添加单个碱基A，再将该片段连接到pBackZero-T载体上，菌液PCR鉴定重组菌，将阳性克隆测序（图2），序列比对结果表明重组质粒序列正确，同源臂供体DNA载体pBackZero-TKu70构建成功。

图2 pBackZero-T-Ku70质粒菌液PCR鉴定M：DNA marker；1～10：单克隆

2.3 筛选鉴定Ku70敲除的多克隆细胞株

将重组质粒pBackZero-T-Ku70分别与3种pCas-gRNA质粒共转染HeLa细胞，72 h后加入终浓度为200 μg/mL的潮霉素进行抗性筛选，15 d后收集细胞，提取细胞总蛋白，Western印迹检测Ku70蛋白的表达水平。结果显示，与对照细胞相比，转染质粒pCas-gRNA3的细胞Ku70条带明显减弱，提示gRNA3敲除效果最佳（图3）。

图3 Western印迹检测多克隆细胞株中Ku70的表达1：未转染的对照细胞；2：pBackZero-T-Ku70载体和pCas-gRNA1载体共转染的细胞；3：pBackZero-T-Ku70载体和pCas-gRNA2载体共转染的细胞；4～7：pBackZero-T-Ku70载体和pCas-gRNA3载体共转染的细胞

2.4 Ku70敲除细胞的基因组PCR鉴定

提取细胞基因组DNA，以K-F/K-R为引物进行PCR鉴定，结果见图4，共转染载体pBackZero-T-Ku70和pCas-gRNA3的细胞基因组DNA，经PCR扩增后在800 bp左右出现目的条带，而未转染的对照细胞没有此条带，表明潮霉素B抗性基因正确插入Ku70基因的特定位点。

图4 基因组PCR鉴定敲除Ku70基因的单克隆细胞株1，2：共转染pBackZero-T-Ku70和pCas-gRNA3的细胞；NC：未转染的细胞

图5 敲除Ku70基因的单克隆细胞株Western印迹鉴定NC：野生型HeLa细胞；1～18：单克隆HeLa细胞株

2.5 分离并鉴定Ku70稳定敲除的单克隆细胞株

用有限稀释法筛选Ku70稳定敲除的HeLa单克隆细胞株。将细胞接种至96孔板，培养1周后选取单克隆细胞进行扩大培养，继而收集细胞，提取细胞提取总蛋白进行Western印迹鉴定（图5）。本次实验共获得18株细胞，其中14号和18号2株为敲除Ku70的单克隆细胞株。

2.6 敲除Ku70基因的稳定细胞株生物学功能检测

2.6.1 细胞增殖实验 用CCK-8法检测敲除Ku70基因的18号细胞株的增殖能力，得到18号Ku70稳定敲除细胞（KO）和野生型HeLa细胞（WT）的生长曲线（图6），与野生型比较，敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖能力明显减弱。

2.6.2 细胞迁移实验 用Transwell方法检测18号细胞株的迁移能力，显微镜下观察并拍照（图7A）；分别统计实验组和对照组穿膜的HeLa细胞数，并进行统计学分析（图7B）。实验结果表明，与野生型细胞相比，敲除Ku70基因的HeLa细胞迁移能力明显减弱。

2.6.3 实时荧光定量PCR分析敲除Ku70基因后HeLa细胞5种miRNA的表达水平 用TRIzol法提取HeLa细胞总RNA，反转录成cDNA，用qPCR仪检测5种miRNA的表达水平。结果见图8，与WT比较，敲除Ku70基因后hsa-miR-649、hsa-miR-562、hsa-miR-544a的表达水平显著上调，hsamiR-548a、hsa-miR-492水平没有显著变化。

图6 Ku70基因稳定敲除细胞株生长曲线（n=3）WT：野生型HeLa细胞；KO：Ku70稳定敲除细胞；*P＜0.05，***P＜0.001

3 讨论

作为C-NHEJ途径中的重要因子，Ku蛋白的DNA断裂修复功能已经有了较为详尽的研究报道。与DNA断裂修复功能类似，Ku蛋白还在保持染色体端粒结构的完整性方面发挥重要作用。在酵母中的研究发现，Ku蛋白能够通过结合端粒酶RNA元件TLC1的48 nt颈环结构，协助招募端粒酶，完成端粒的延伸[11-12]。但随后又有研究表明，人Ku蛋白能够结合端粒酶47 nt的RNA元件hTR，而hTR与TLC1并没有相似序列[13]。Ku70还被证实能够通过结合细胞凋亡促进因子Bax，抑制细胞凋亡。在个体水平上，Ku蛋白还被证实与衰老有关。单独敲除Ku70或Ku80，或者二者都敲除的小鼠，均出现了类似的加速衰老现象[14]。猜测这可能与影响了C-NHEJ途径有关，因为衰老的大鼠神经元细胞内和阿尔兹海默患者脑组织内的C-NHEJ途径均明显减弱。缺失了Ku蛋白的作用后，C-NHEJ途径将进一步减弱，这或许最终导致细胞和个体衰老加速[15-16]。这些研?究结果提示，Ku蛋白的生物学功能十分广泛，还需要进一步挖掘。

图7 Ku70基因稳定敲除细胞株迁移能力检测（n=3）WT：野生型HeLa细胞；KO：Ku70稳定敲除细胞；**P＜0.01

图8 qPCR检测敲除Ku70后HeLa细胞5种miRNA的表达水平（n=3）WT：野生型HeLa细胞；KO：Ku70稳定敲除细胞；**P＜0.01，***P＜0.001

Ku蛋白结合DNA的特异性早已确定，并且已经有研究证明Ku蛋白与DNA的结合并不是依赖特定序列或碱基的[17]。生物化学分析结果显示，Ku70亚基的3个结构域（ɑ/β结构域、DNA结合结构域、Ku80结合结构域）对于Ku蛋白聚集在双链断裂DNA末端是必需的[18]。细胞实验表明Ku70蛋白能够作为细胞内的模式受体识别外来的病毒DNA，进而介导Ⅲ型干扰素的产生[19]。此外，Ku蛋白的RNA结合特异性也被证实。比如上面提到的Ku蛋白在维持端粒结构的过程中，就发挥了招募端粒酶RNA元件的功能。有报道称Ku70蛋白能够与一类具有颈环结构并且带有一个突出基序的RNA特异结合，这表明Ku70与RNA的结合是空间特异性的[20-21]。

为了便于深入研究Ku70蛋白的生物学功能，我们构建了Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株，为后续实验奠定了基础。我们检测了Ku70稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力等生物学功能，结果表明敲除Ku70基因后HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱，提示Ku70可能参与了HeLa细胞的增殖和迁移过程。此外，我们前期的实验结果提示Ku70蛋白可能调节miRNA表达（结果未显示），而本研究中，我们尝试检测Ku70稳定敲除细胞株中几种可能被Ku70蛋白调节的miRNA表达水平。RT-qPCR结果显示，3种miRNA在敲除Ku70基因的HeLa细胞中明显上调，提示Ku70可能参与了这些miRNA的表达调控，相关的分子机制还有待进一步研究。

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