卢建博,郑文铝,,余云舟,叶建强,戴秋云,刘珠果
1.军事医学研究院 生物工程研究所,北京 100071;2.扬州大学 兽医学院,江苏 扬州 225100
水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)属弹状病毒科,为不分节段的单股负链RNA病毒。负链RNA病毒的包装需要RNA与核衣壳蛋白形成有活性的核糖核蛋白,以此作为RNA依赖的RNA聚合酶的模板,所以单纯的负链RNA无感染性,且病毒复制周期中没有出现DNA环节,病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组中,因此来源于改构的VSV的重组VSV(rVSV)载体疫苗具有较高的安全性。近年来,随着流感、埃博拉病毒病和寨卡病毒病等大规模暴发,其疫苗的研制已被世界各国广泛关注。以rVSV为载体的疫苗已研究多年,具有免疫效率高、无预存免疫等优点,已用于人类免疫缺陷病毒、流感病毒[1]、尼帕病毒[1]、埃博拉病毒[2-5]、马尔堡病毒[6-7]和中东呼吸综合征冠状病毒[8]等的疫苗研究,其中以rVSV为载体的埃博拉疫苗已经完成Ⅲ期临床试验并提交美国FDA审批[9]。
此外,VSV能在多种细胞中高滴度快速生长,可建立VSV反向遗传操作系统[10-12],特别适合于丝状病毒及黄热病毒疫苗的设计及制备。表达外源基因的rVSV的稳定高效包装是制备rVSV载体疫苗的关键环节。提高病毒包装的成功率,除须准确合成病毒的基因组cDNA外,病毒包装细胞系的选择、rVSV骨架质粒和辅助质粒的用量、重组痘病毒(vTF7-3)的感染时间、转染试剂作用时间等均影响病毒的稳定高效包装。本实验室根据文献报道的条件进行了rVSV的包装,发现其包装效率较低,稳定性不高[13-16]。本研究中,我们对该系统包装条件进行探索及优化,为建立表达外源基因的rVSV载体疫苗奠定了坚实基础。
BHK21-WI2细胞购自Kerafast公司;293T细胞购自Clontech公司;重组痘病毒vTF7-3购自ATCC公司;prVSVΔG-GFP骨架质粒、辅助质粒(pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L)、pCAGGS-G由MichaelA.Whitt教授馈赠;转染试剂 Lipo⁃fectAMINE 2000购自Invitrogen公司;Opti-MEM培养基、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶(0.25%)、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;96孔细胞培养板购自Corning公司;6孔细胞培养板购自NEST公司;0.22 μm针头滤器购自Millipore公司;TH4-200型倒置荧光显微镜为Olympus公司产品。
1.2.1 细胞接种 以3.5×105~5×105/孔接种至6孔细胞培养板,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培育14~16 h,使细胞密度达到85%~95%,同一细胞系后续操作中培育条件不变。
1.2.2 vTF7-3感染细胞 自-80℃取出冻存的vTF7-3至37℃快速解冻,加入37℃预热的无血清DMEM培养基,混匀病毒液,移除1.2.1项中的培养基,用37℃预热的无血清DMEM漂洗细胞,将病毒液接种至6孔细胞培养板(MOI=5),在培养箱中孵育1 h。
1.2.3 质粒体系配制 将prVSVΔG-GFP骨架质粒、辅助质粒(pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L)分别以5、3、5、8、1 μg/孔移取。
1.2.4 转染试剂配制及准备 将1.2.3项中的质粒移至含500 μL Opti-MEM培养基的1.5 mL离心管中混匀,记为A管;LipofectAMINE 2000与质粒以2.5~5 μL∶1 μg的比例添加到含500 μL Opti-MEM培养基的1.5 mL离心管中混匀,记为B管,室温静置5 min;将B管移入A管并混匀,室温静置20 min。
1.2.5 转染细胞并观察 弃除1.2.2项中的培养液,移入1.2.4项中转染试剂,轻摇混匀,培养6 h后更换为含5%FBS的DMEM培养基,继续培养48 h,荧光显微镜观察细胞病变(CPE)及荧光。
1.2.6 病毒收获 从6孔细胞培养板上刮下细胞,反复吹打,经0.22 μm针头滤器过滤,收集滤液,冻存于-80℃备用。
1.2.7 pCAGGS-G质粒转染BHK21-WI2细胞 按1.2.1项接种细胞,pCAGGS-G质粒为2 μg/孔,用LipofectAMINE 2000转染细胞,培养至细胞出现明显的合胞体。
1.2.8 病毒扩增 取1.2.6项中初次包装病毒至37℃快速解冻,按500 μL/孔移至1.2.7项中已弃除培养液的细胞中,于细胞培养箱中感染1 h,每隔15 min轻微摇晃,然后以1.5 mL/孔添加预热的含5%FBS的DMEM培养基,继续培养48 h,观察CPE及荧光变化。
1.3.1 辅助质粒用量比较 选取293T细胞用于病毒包装,实验方法同1.2,辅助质粒的比例与方法1.2.3项中辅助质粒比例相同,用量在原基础上减至1/2(8.50 μg)、1/4(4.25 μg)、1/6(2.83 μg)、1/8(2.16 μg)、1/10(1.70 μg)。
1.3.2 质粒总用量比较 选取293T细胞用于病毒包装,实验方法同1.2,质粒的比例与方法与
1.2.3项相同,骨架质粒及辅助质粒总量均减为原用量的1/2(11.00 μg)、1/4(8.50 μg)、1/6(3.67 μg)、1/8(2.75 μg)、1/10(2.20 μg)。
1.3.3 包装细胞系比较 以1.3.1与1.3.2项的结果确定优化的质粒用量,实验方法同1.2,将BHK21-WI2作为病毒包装细胞系,BHK21-WI2细胞培养需7.5%CO2。
1.3.4 重组痘病毒vTF7-3作用时间比较 以
1.3.3的优化结果确定质粒用量及细胞系,实验方法同1.2。将重组痘病毒vTF7-3在作用1 h后移弃,更换为500 μL Opti-MEM培养基继续作用1.5和3 h。
1.3.5 转染试剂作用时间组 以1.3.3项优化结果确定质粒用量及细胞系,实验方法同1.2,将包装质粒转染时间在6 h基础上增加至8、10、12、14 h。
收集BHK21-WI2细胞,用含5%FBS的DMEM配制成2×105/mL的细胞悬液,以100 μL/孔接种至96孔细胞培养板,然后于37℃快速解冻1.3项各批次病毒,按10-1~10-10梯度稀释至无血清DMEM中,再添加至96孔细胞培养板,各梯度设置5个复孔,培养4~7 d。观察细胞形态及荧光变化,统计CPE孔数,按Karber法计算病毒滴度。
在prVSVΔG-GFP骨架质粒基础上,构建缺失VSV的包膜糖蛋白(GP)基因而带有寨卡病毒包膜蛋白(E)基因的VSV重组质粒prVSVΔG-ZE,按1.2方法及1.3项优化条件进行病毒包装,并测定病毒滴度。
在病毒扩增阶段,BHK21-WI2细胞先转染pCAGGS-G质粒至逐渐融合、形成大小不等的合胞体(图1C),随后,细胞在感染rVSVΔG-GFP后,逐渐出现皱缩、变圆、脱落、漂浮等现象(图1A),在荧光显微镜下观察到明亮的绿色荧光(图1B)。由于BHK21-WI2细胞CPE变化较293T细胞显著,因此选择BHK21-WI2细胞用于观察。
图1 病毒感染BHK21-WI2细胞后的CPE变化(100×)A:rVSVΔG-GFP感染细胞(光镜);B:rVSVΔG-GFP感染细胞(荧光);C:转染pCAGGS-G质粒细胞(光镜);D:转染pCAGGSG质粒细胞(荧光)
不同条件包装病毒TCID50结果见表1。在辅助质粒单独递减时,病毒滴度降低;在骨架质粒及辅助质粒同时递减时,滴度降低,但趋势较小。不同细胞系包装rVSV时,293T细胞组包装病毒滴度远高于BHK21-WI2细胞组,延长vTF7-3作用时间或转染时间后,BHK21-WI2细胞系包装病毒滴度有一定提高。
表1 TCID50法测定rVSVΔG-GFP滴度
本实验中rVSVΔG-GFP为复制缺陷型重组病毒,包装过程中还用到辅助质粒pBS-G、pBS-N、pBS-P、pBS-L,其比例为8∶3∶5∶1[17]。荧光观察结果显示,总质粒用量递减对荧光细胞数量影响不明显(图2A),但骨架质粒用量不变时,荧光细胞数量随辅助质粒用量递减而减少(图2B)。滴度测定结果显示总质粒用量为3.67~22 μg时可高效包装rVSVΔG-GFP,各组滴度变化差异不明显,总质粒用量低于3.67 μg时包装效率明显降低。骨架质粒为5 μg时,辅助质粒(pBS-N、pBS-P、pBS-L)的合适用量为3~9 μg,用量低于3 μg时包装效率极低。骨架质粒与辅助质粒用量较低时,或造成病毒基因组RNA及N、P、L蛋白表达量过低,而骨架质粒与辅助质粒比例相差过大时难以形成持续复制单位。这与已报道的rVSV载体非复制缺陷型疫苗包装条件较为一致[14],各文献中骨架质粒用量为2~6 μg,辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-L比例近似为3∶5∶1,用量2~9 μg。
图2 不同质粒用量病毒感染BHK21-WI2细胞后CPE变化及荧光结果(100×)A1~A4:总质粒用量依次为1/2(11.00 μg)、1/4(8.50 μg)、1/6(3.67 μg)、1/8(2.75 μg);B1~B4:辅助质粒用量依次为(1/2(8.50 μg)、1/4(4.25 μg)、1/6(2.83 μg)、1/8(2.16 μg)
以2.3项结果确定优化的质粒用量为原骨架质粒和辅助质粒总量的1/2(11.00 μg),分别考察293T、BHK21-WI2细胞的包装效率。实验发现293T细胞系荧光细胞数量及包装稳定性显著优于BHK21-WI2细胞系(图3),且293T细胞包装能获得高滴度的病毒。293T细胞感染病毒时CPE不明显,生长较慢,而BHK21-WI2细胞包装效率低于同条件包装的293T细胞,生长快速,感染病毒后CPE明显[14,17]。另外,我们还尝试了BHK21和293T/Vero E6混合细胞进行病毒包装,293T/ Vero E6混合细胞体系包装效率高于BHK21-WI2细胞,BHK21-WI2细胞与BHK21细胞包装效率差异不明显。
采用BHK21-WI2细胞包装时,荧光细胞数目较少且稳定性较差,我们期望通过延长vTF7-3的作用时间来提高其病毒包装效率。将vTF7-3的作用时间在1 h基础上分别延至1.5和3 h,发现均可成功包装病毒,且荧光细胞数量增多,滴度略有提高。结合前期实验发现vTF7-3以5~15 MOI感染细胞1 h或以5 MOI感染细胞1~4 h可成功包装病毒。当vTF7-3低于1 MOI感染1 h时,产生的T7RNA聚合酶量过少,导致后续包装效率低。当vTF7-3用量大于15 MOI或感染时间超过4 h时,包装效率变化不明显,甚至由于vTF7-3大量扩增抑制VSV包装。该结果与国外报道有部分差异,文献报道vTF7-3用量为5~10 MOI、感染时间45~60 min[18]。最近也有采用重组真核载体表达T7RNA聚合酶,而不用vTF7-3的报道[18]。
同样为提高BHK21-WI2细胞包装效率,将转染试剂作用时间延长至8、10、12、14 h,其他条件不变。本实验中质粒转染细胞时间为6~14 h时包装效果较好,可见适当提高转染时间有利于提高包装效率。当转染时间小于6 h时,质粒进入细胞量过少,包装效率低。转染时间长于14 h时包装效率未能提高甚至出现降低,这可能是转染试剂作用时间过长导致细胞损伤,该结果比国外报道的转染细胞时间(4~7 h)长[18]。
图3 不同包装细胞系包装病毒感染BHK21-WI2细胞后的荧光观察结果(100×)A:293T包装细胞系组;B:BHK21-WI2包装细胞系组;C:转染pCAGGS-G质粒的对照细胞组
在rVSVΔG-GFP包装条件优化基础上,对rVSVΔG-ZE进行了病毒包装尝试,条件见表2。结果显示,在3种条件下实验组均出现明显的CPE,如图4所示,病毒均能包装且滴度较高。
表2 TCID50法测定rVSVΔG-ZE滴度
rVSV的包装包括以下几个主要方面:重组痘病毒vTF7-3感染细胞表达T7RNA聚合酶、转染的辅助质粒分别表达相应蛋白(核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、包膜蛋白G及大聚合酶蛋白L),骨架质粒转录生成病毒基因组RNA,核蛋白N与基因组RNA组装形成持续复制单位[17,19]。我们基于这些方面考察重组痘病毒vTF7-3的作用时间、总质粒用量与辅助质粒用量、质粒转染时间以及细胞系对rVSV包装效率的影响。此外,表达的外源蛋白也是影响rVSV包装的重要因素,如表达的外源蛋白有类似VSV野生型包膜GP蛋白的介导病毒与膜融合的性质,则包装效率高、扩增能力强,而类似GFP自身无包膜蛋白性质,则需要借助辅助质粒pBS-G包装形成复制缺陷性重组病毒,包装效率、扩增能力较低。VSV病毒包装是一个多条件影响的过程,单一适宜条件或许能得到病毒,但综合优化各个条件才能获得稳定高效的高滴度病毒株。
图4 rVSVΔG-ZE组感染BHK21-WI2细胞结果(100×)A:1/2(11.00 μg)全质粒293T细胞包装组;B:1/2(8.50 μg)辅助质粒293T细胞包装组;C:1/2(11.00 μg)质粒vTF7-3作用4 h转染试剂作用14 h于BHK21-WI2细胞包装组;D:转染pCAGGS-G质粒的对照细胞组
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