吴茱萸和臭辣吴萸果实化学成分及不同采收时间主要成分含量的变化

李懿恒， 黄佳楠， 刘　潇， 印　敏， 刘　飞， 冯　煦， 王奇志

〔江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏省植物资源研究与利用重点实验室 江苏省农业种质资源保护与利用平台， 江苏 南京 210014〕

吴茱萸〔Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.〕及其变种石虎〔E.rutaecarpavar.officinalis(Dode) Huang〕和疏毛吴茱萸〔E.rutaecarpavar.bodinieri(Dode) Huang〕的干燥近成熟果实均为中药材吴茱萸的原植物，可散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻，其天然成分对心血管系统、胃肠道系统和免疫系统也有一定功效[1]171，[2-3]。吴茱萸果实主要含生物碱、苦味素和挥发油等[4]，吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素含量是吴茱萸药材质量的评价标准[1]172。近年来，对吴茱萸的研究多集中于其不同产地和品种的药用成分研究[5-6]。同属的臭辣吴萸(E.fargesiiDode)果实在湖北民间用作吴茱萸代品，具相同药效[7]。为进一步明确吴茱萸和臭辣吴萸果实的化学成分，弄清药用有效成分随采收时间的变化规律，作者对吴茱萸和臭辣吴萸果实的化学成分进行了分离和鉴定，并分析了不同采收时间二者果实中主要成分含量的变化。

1　材料和方法

1.1　材料

吴茱萸和臭辣吴萸的果实均采自南京中山植物园药用植物园内，经姚淦副研究员鉴定。吴茱萸和臭辣吴萸果实的采集时间分别为2017年的7月初至9月底及6月中旬至9月初；均按果熟过程采集，每隔7～15 d采收1次。每次采集果实3份，每份25 g以上，于50 ℃烘箱中烘干至恒质量，密封保存、备用；其中，8月14日采集的果实样品用于成分鉴定。

主要仪器为1260UPLC-6530Q-TOF-MS液质联用仪，配有电喷雾离子源(ESI)(美国Agilent Technologies公司)。去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹诺酮、吴茱萸卡品碱和二氢吴茱萸卡品碱对照品均为本实验室自制(纯度高于98.0%)。

1.2　方法

1.2.1UPLC-Q-TOF-MS分析色谱条件：Agilent ZORBAX SB-AQ C18色谱柱(4.6 mm×100 mm，1.8 μm)。流动相A为甲醇、流动相B为体积分数0.1%甲酸，梯度洗脱流程为20%～80%A(1～50 min)、80%～100%A(50～80 min)、100%A(80～100 min)；流速0.3 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量5 μL；200～400 nm全波长扫描，吲哚喹唑啉类、喹诺酮类和柠檬苦素的检测波长分别为290、325和215 nm。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；质量扫描范围(m/z)100～1 000；毛细管电压4 000 V；碎裂电压180 V；干燥气(N2)流速10 L·min-1，温度350 ℃；雾化气压力344.75 kPa；碰撞诱导解离(CID)能量35 eV；碰撞气为N2。

1.2.2标准曲线绘制精密称取上述对照品适量，用甲醇分别溶解并配制成质量浓度分别为1.00、1.00、0.40、0.65、1.04、1.01和1.06 mg·mL-1的对照品溶液。

分别精密吸取上述对照品溶液0.01、0.05、0.10、0.25和0.50 mL，用甲醇补足至1.00 mL，按上述色谱和质谱条件测定；并以峰面积为纵坐标(y)、对照品质量为横坐标(x)绘制各对照品的标准曲线。去氢吴茱萸碱标准曲线为y=(4.22×103)x+203.63(r=0.999 4)，线性范围0.05～5.00 μg；柠檬苦素标准曲线为y=(1.59×103)x+35.34(r=0.999 7)，线性范围0.05～5.00 μg；吴茱萸碱标准曲线为y=(6.30×103)x-138.11(r=0.999 1)，线性范围0.02～2.00 μg；吴茱萸次碱标准曲线为y=(1.21×103)x+101.77(r=0.999 6)，线性范围0.03～3.25 μg；1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹诺酮标准曲线为y=(6.16×103)x+119.13(r=0.999 5)，线性范围0.05～5.02 μg；吴茱萸卡品碱标准曲线为y=(5.90×103)x+92.23(r=0.999 0)，线性范围0.05～5.01 μg；二氢吴茱萸卡品碱标准曲线为y=(6.45×103)x+8.06(r=0.999 8)，线性范围0.05～5.03 μg。

1.2.3样品溶液制备和测定称取样品0.50 g，加入甲醇20 mL，常温下浸泡1 h，称量质量；超声(100 kHz，40 ℃)提取60 min，用甲醇补足损失的质量；取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得样品溶液。按上述色谱和质谱条件测定，每个样品3份，每份样品重复测定3次。

1.2.4方法学考察取吴茱萸碱对照品溶液，按上述色谱和质谱条件测定6次，峰面积的RSD值为0.98%～3.04%，表明仪器精密度良好。取2017年8月4日采集的吴茱萸果实样品溶液，分别在0、4、8、12、18和24 h按上述色谱和质谱条件测定，峰面积的RSD值为0.89%～3.65%，表明样品溶液在24 h内基本稳定。取2017年8月4日采集的吴茱萸果实样品6份并制成样品溶液，按上述色谱和质谱条件测定，峰面积的RSD值为1.28%～2.57%，表明该方法重复性良好。

1.3　数据分析

使用MassHunter 5.0工作站和PCDL B.03.01数据库对各样品的总离子流图和质谱数据进行分析，对各化合物相对分子质量的实际值与理论值进行比较，结合二级质谱信息和相关文献资料[8-10]鉴定化合物。依据各对照品的标准曲线，采用外标法确定样品溶液中各化合物的质量，并根据公式“化合物含量=〔(化合物质量×提取量)/(果实质量×进样量)〕×100%”计算供试果实样品中各化合物的含量(质量分数)。

2结果和分析

2.1　吴茱萸和臭辣吴萸果实的共有成分分析

从吴茱萸和臭辣吴萸果实中鉴定出13种共有成分(表1)，包括去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-[(Z)-5-十一烯]-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹诺酮、吴茱萸卡品碱、1-甲基-2-十二烷基-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-[(6Z，9Z)-6，9-十五碳二烯]-4(1H)-喹诺酮、二氢吴茱萸卡品碱、1-甲基-2-[(Z)-9-十五烯]-4(1H)-喹诺酮和1-甲基-2-十五烷基-4(1H)-喹诺酮，这13种共有成分主要为吲哚喹唑啉类、柠檬苦素和喹诺酮类等。

表1吴茱萸和臭辣吴萸果实的共有成分

Table1CommonconstituentsinfruitsofEvodiarutaecarpa(Juss.)Benth.andE.fargesiiDode

保留时间/minRetentiontime正离子Positiveion(m/z)相对分子质量Relativemolecularmass特征碎片离子Characteristicfragmention(m/z)化合物Compound22.61302.1471301258,272,286dehydroevodiamine37.01471.2003470161,425,443limonin49.68304.1414303134,161,230evodiamine54.01288.1213287169,273rutaecarpine59.27286.2497285173,186,2301-methyl-2-nonyl-4(1H)-quinolone61.75312.2298311173,1861-methyl-2-[(Z)-5-undecenyl]-4(1H)-quinolone66.35314.29993131731-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolone68.52340.2835339186evocarpine69.84328.2609328173,1861-methyl-2-dodecyl-4(1H)-quinolone70.96366.31743651861-methyl-2-[(6Z,9Z)-6,9-pentadecadienyl]-4(1H)-quinolone73.11342.3197342173dihydroevocarpine74.78368.31023671861-methyl-2-[(Z)-9-pentadecenyl]-4(1H)-quinolone78.90370.3204369173,1861-methyl-2-pentadecyl-4(1H)-quinolone

2.2　不同采收时间果实中主要成分含量的动态变化

实验结果(表2)表明：在吴茱萸果实中，吲哚喹唑啉类(吴茱萸碱、吴茱萸次碱和去氢吴茱萸碱)含量在9月5日达到峰值(1.509 7%)，柠檬苦素含量在8月24日达到峰值(0.429 2%)，喹诺酮类〔1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹诺酮、吴茱萸卡品碱和二氢吴茱萸卡品碱〕含量在8月14日达到峰值(0.189 6%)。在臭辣吴萸果实中，吲哚喹唑啉类含量在8月14日达到峰值(0.215 2%)，柠檬苦素含量在8月4日达到峰值(0.521 1%)，喹诺酮类含量在7月17日达到峰值(0.215 9%)。

果初期吴茱萸果实中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和二氢吴茱萸卡品碱的含量均低于臭辣吴萸，但随果实成熟，3种成分的含量明显上升，峰值均高于臭辣吴萸。果初期吴茱萸果实中柠檬苦素含量虽高于臭辣吴萸，但随果实成熟，后者果实中柠檬苦素含量增幅明显，导致中后期采收的吴茱萸果实中柠檬苦素含量低于后者。在整个果期，吴茱萸果实中去氢吴茱萸碱和吴茱萸卡品碱的含量均高于臭辣吴萸，而1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹诺酮的含量则低于臭辣吴萸。

表2不同采收时间吴茱萸和臭辣吴萸果实中主要成分的含量

Table2ContentsofmainconstituentsinfruitsofEvodiarutaecarpa(Juss.)Benth.andE.fargesiiDodeatdifferentharvestingtimes

采收时间Harvestingtime(MM-DD)吴茱萸果实中主要成分的含量/%1)ContentofmainconstituentsinE.rutaecarpafruit1)1234567采收时间Harvestingtime(MM-DD)臭辣吴萸果实中主要成分的含量/%1)ContentofmainconstituentsinE.fargesiifruit1)123456707-100.04200.07020.00980.03220.00400.03020.012706-150.00720.05410.01320.03290.11260.00540.020707-170.08470.12150.01930.03970.01050.04720.018006-300.00810.06810.01660.03630.12560.00750.022107-240.12330.23570.02880.07290.01620.06600.028107-100.02230.10820.02570.04440.12970.00990.028708-040.14690.32280.06160.12390.02070.07800.041407-170.03460.32430.04790.08720.16660.01380.035508-140.21050.34680.23340.29090.02400.08870.076907-240.04120.47540.04510.08410.12620.01100.041408-240.24300.42920.33900.36880.01350.06450.043008-040.05650.52110.05350.09140.10550.00890.031109-050.18090.34680.60420.72460.01170.05230.061808-140.07310.50470.06630.07580.06620.01180.022409-150.15500.30390.55430.73130.01040.04430.049108-240.06180.46640.04820.07440.05910.01010.016409-250.15720.27810.58310.70170.01020.05200.052609-050.04730.39830.03210.06530.05000.00760.0122

1)1： 去氢吴茱萸碱Dehydroevodiamine； 2： 柠檬苦素Limonin； 3： 吴茱萸碱Evodiamine； 4： 吴茱萸次碱Rutaecarpine； 5： 1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹诺酮1-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolone； 6： 吴茱萸卡品碱Evocarpine； 7： 二氢吴茱萸卡品碱Dihydroevocarpine.

3讨论和结论

从吴茱萸和臭辣吴萸果实共鉴定出13种共有成分，主要为吲哚喹唑啉类、柠檬苦素和喹诺酮类3类成分。根据果期吴茱萸和臭辣吴萸果实中7种主要成分含量的动态变化趋势，确定吴茱萸果实的适宜采收期为8月底至9月初，臭辣吴萸果实的适宜采收期为7月底至8月中。吴茱萸和臭辣吴萸果实中3类成分的动态变化趋势基本一致，均随果熟过程先升高后降低，但柠檬苦素和喹诺酮类含量达到峰值的时间均早于吲哚喹唑啉类；臭辣吴萸果实中柠檬苦素和喹诺酮类含量的峰值均略高于吴茱萸，而其吲哚喹唑啉类含量的峰值远低于吴茱萸。从整体上看，在适宜的采收期内臭辣吴萸果实中3类成分的总含量低于吴茱萸，其药材品质略低于后者，因此，将臭辣吴萸作为吴茱萸替代品入药有一定的合理性，但需进一步研究其药材品质、用量及质量控制标准。

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