电针对局灶脑缺血/再灌注模型大鼠大脑缺血皮质区P2X7R与NLRP3炎性小体表达的影响

卞炜，秦文熠

（1重庆市永川区中医院康复科 重庆 402160，2重庆医科大学附属第一医院中西医结合科 重庆 400016)

缺血性脑卒中具有高致死率和致残率[1]。脑再灌注后炎性反应是局灶脑缺血/再灌注众多复杂病生理机制中的关键环节[2]，也是决定卒中预后的主要因素[3]。研究表明，Nod样受体蛋白3（NOD-like receptor pyrin 3，NLRP3）炎性小体在脑缺血损伤后炎症级联反应中发挥着重要作用[4-81]。NLRP3炎性小体的激活有3种模式：ATP-P2X7R受体介导离子通道的开放引起胞内钾离子外流、活性氧的诱导和溶酶体破坏引发组织蛋白酶的释放，第一种是最主要的激活模式[2-3]。嘌呤受体配体门控性离子通道7（purinergic 2X7 receptor，P2X7R）是一种配体门控离子通道，细胞损伤时释放的大量ATP可激活P2X7R[4-56]。研究表明，P2X7R是NLRP3炎性小体激活的关键调节因子[7-8]，激活的NLRP3炎性小体可活化caspase-1，促进多种细胞因子如IL-1β和IL-18的成熟和分泌并作用于多种效应细胞[16]。脑缺血/再灌注早期脑内小胶质细胞可通过P2X7R/NLRP3信号途经调控炎症反应[6，17]，大量研究表明，电针治疗可减轻脑缺血/再灌注损伤早期炎性反应[18-20]。本研究通过观察电针对局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑缺血皮质区P2X7R、NLRP3表达影响，探讨P2X7R、NLRP3在电针调控局灶脑缺血/再灌注炎性损伤中的可能作用。

材料与方法

1 局灶脑缺血/再灌注模型建立

SPF级雄性SD大鼠，体重250-300 g，由重庆医科大学动物实验中心提供（动物使用许可证号：SYXK（渝）2012-0001）。按随机原则将大鼠分为假手术组（sham组）、模型组（I/R组）、模型+电针组（I/RE组），每组16只，大鼠术前禁食12h，不禁饮。大鼠采用Longa等[21]改良线栓法规范化制备大鼠右侧大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。3.5%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉大鼠，颈部备皮消毒后行颈正中纵行切口，充分暴露右侧颈总动脉（CCA），分离颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）颅外段，凝断甲状腺动脉及交通支动脉后，烧断ECA游离备用，蛙心夹暂时夹闭ICA，在ECA残端剪一小口，缓慢插入预先准备的头端圆钝、直接约0.25～0.27mm的线栓，线栓经CCA分叉处进入ICA，线栓头端距离分叉处约18～20mm处感插线栓有明显阻力，表示线栓头端已到达大脑中动脉起始端，停止继续推进栓子，固定线栓，颈部创口缝合消毒后放置37℃恒温台保温待醒。栓塞90min后拔出线栓至ECA残端实现再灌注。Sham组尼龙线栓插入10mm左右深度进入ICA颅外部即可，其余操作同上待大鼠完全清醒后，采用Bederson 5分法[11]进行神经功能评分，1-3分者入选实验。凡因各种原因导致各实验组动物数不足预定数量者，均按照随机抽样原则补齐实验动物。

2 电针干预方法

参照中国针灸学会实验针灸委员会制定的实验动物穴位图谱，对I/RE组大鼠于再灌注后0、12h、24h行电针治疗，选取大鼠“百会”、左侧“四关”（“合谷”和“太冲”）为电针穴位，刺激参数采用频率为2/100 Hz，波型为疏密波，电流强度为1mA，20min/次。

3 主要试剂和仪器

P2X7R多克隆抗体（CST公司，英国）、NLRP3多克隆抗体（CST公司，英国）、Iba-1多克隆抗体（Novus公司，美国），驴抗山羊荧光二抗-FITC(Proteintech，SA00003-3，1:200)，IL-1β 和 IL-18 ELISA试剂盒（碧云天，中国），荧光定量PCR相关试剂（Takara公司，日本），P2X7R和NLRP3引物（上海生物生工有限公司合成），G6850型电针治疗仪（购自北京精工仪器厂），电泳、电转仪及凝胶成像仪（Bio-Rad公司，美国），激光扫描共聚焦显微镜（Nikon，东京，日本）。

4 Western blot

取缺血区大脑皮质约100mg加入蛋白裂解液（RIPA:PMSF=100:1），彻底匀浆后静置30min，4℃10000r/min离心10min，取上清液，即为全蛋白提取物。采用BCA蛋白定量法检测所提蛋白浓度。用4×上样缓冲液将剩余蛋白稀释成相同浓度，后100℃沸水中煮5min，-80℃保存。以10μg上样量行SDSPAGE凝胶电泳（10%分离胶，12%浓缩胶），恒压操作60～100V电泳约2.5h，将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭90min，孵育一抗（P2X7R、NLRP3抗体稀释比例为1:1000），4℃过夜后复温2h，TBST洗膜后孵育二抗（稀释比例为1:2000）2h，TBST洗膜后ECL凝胶成像仪显影，采用Fusion软件进行光密度分析。

5 荧光定量RT-PCR

再灌注24h后，于冰上迅速切取右侧缺血半暗带脑组织置于玻璃匀浆器中，用Trizol裂解液，按TAKALA试剂盒说明书提取缺血半暗带组织内总mRNA。取1μl mRNA，按照逆转录试剂盒进行逆转录得到cDNA。将含有SyberGreen的TaqMan (10μl体系)进行荧光定量聚合酶链反应。按照Pubmed上GenBank提供的序列由TAKALA公司合成引物：NLRP3上游引物5’-GTGTTTCGAAATCCCACTGTG-3’， 下 游 引 物 5’-TCTGCTTCTCACGTATTTCTG-3’，P2X7R 上 游 引 物5’-GAACAATATCACTTCCCCGG-3’， 下 游 引 物5’-TTATCGCCTGTTTCTCGGAAG-3’， GAPDH 上游引物 5’-ATGACATCAAGAGGTGGTG-3’，下游引物5’-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3’。RT-PCR反应条件为：预变形95℃，变性95℃ 15s，退火/延伸57℃ 1min，40个循环。

6 ELISA

于再灌注后24h，采用ELISA试剂盒检测缺血侧大脑皮质IL-1β和IL-18含量。首先需根据标准品的浓度及相应OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据各样品的OD值，利用回归方程计算出各样品的浓度。

7 免疫荧光

将大鼠脑组织冰冻切片置于预冷的丙酮常温固30min，后用0.1% triton 37℃固定30min，取出PBS冲洗3次，采用5% 驴血清固定37℃封闭1h，甩干血清，滴加Iba-1一抗（稀释比例为1:200）于4℃过夜。次日切片37℃复温1 h，避光37 ℃孵育FITC标记的驴抗山羊荧光二抗1h，后DAPI 37 ℃孵育10min，PBS冲洗3次，50%甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察、拍照。

8 统计学分析

结 果

1 电针抑制脑缺血/再灌注神经功能损伤

假手术组大鼠均无神经功能障碍表现（0分）。再灌注后24h，模型组和电针组大鼠均出现不同程度神经功能缺损症状，且电针组神经功能缺损评分较模型组降低（表1）。

图1 各组大鼠Bederson神经功能评分的比较。##，与I/R组比较，P＜0.01Fig. 1 Bederson behavior score comparison. ##, P＜0.01, compared with I/R group

2 电针抑制脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血区P2X7R表达上调

Western blot检测显示，再灌注后24h，模型组P2X7R蛋白表达较假手术组明显升高，电针组P2X7R水平明显低于模型组（图2A、B）。RT-qPCR分析显示，再灌注后24h，模型组P2X7R mRNA较假手术组明显升高，电针可明显降低模型组P2X7R表达（图2C）。

3 电针抑制脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血区NLRP3表达上调

Western blot检测显示，再灌注后24h，模型组NLRP3蛋白表达较假手术组明显升高，电针组NLRP3水平明显低于模型组（图3A、B）。RT-qPCR分析显示，再灌注后24h，模型组NLRP3 mRNA较假手术组明显升高，电针可明显降低模型组NLRP3表达（图3C）。

图2 电针抑制脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血区P2X7R表达。A，代表性Western blot结果；B，P2X7R水平的统计学分析；C，P2X7R mRNA水平RT-qPCR检测的统计学分析；*，与sham组比较，0.01＜P＜0.05； ***，与sham组比较，P＜0.001；#，与I/R组比较，0.01＜P＜0.05；##，与I/R组比较，P＜0.01Fig. 2 Effect of electroacupuncture on P2X7R expression in ischemic cerebral cortex of I/R rats. A, representative results of Western blot; B, statistical analysis of P2X7R protein level; C, statistical naalysis of P2X7R mRNA level detected by RT-qPCR; *, 0.01＜P＜0.05; ***, P＜0.001, compared with sham group; #, 0.01＜P＜0.05; ##, P＜0.01, compared with group I/R

图3 电针抑制脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血区的NLRP3表达。A，代表性Western blot结果；B，NLRP3水平的统计学分析；C，NLRP3 mRNA水平RT-qPCR检测的统计学分析；**，与sham组比较，P＜0.01；***，与sham组比较，P＜0.001；#，与I/R组比较，0.01＜P＜0.05；##，与I/R组比较，P＜0.01Fig. 3 Effect of electroacupuncture on NLRP3 expression in ischemic cerebral cortex of I/R rats. A, representative results of Western blot; B, statistical analysis for NLRP3 protein level; C, statistical analysis of NLRP3 mRNA level detected by RT-qPCR; **, P＜0.01; ***, P＜0.001, compared with sham group; #, 0.01＜P＜0.05; ##, P＜0.01, compared with group I/R

4 电针抑制脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血区IL-1β和IL-18表达上调

ELISA检测显示，再灌注后24h，模型组脑组织中IL-1β和IL-18含量较假手术组明显升高，电针组脑组织中IL-1β和IL-18含量明显低于模型组（图4）。

图4 电针减弱脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血区IL-1β和IL-18含量。A，ELISA检测的IL-1β表达水平统计学分析；B，ELISA检测的IL-18表达水平统计学分析； ***，与sham组比较，P＜0.001；###，与I/R组比较，P＜0.001Fig. 4 Effect of electroacupuncture on IL-1β and IL-18 levels in ischemic cerebral cortex of I/R rats . A, statistical analysis of IL-1β level detected by ELISA; B, statistical analysis of IL-18 level detected by ELISA; ***, P＜0.001, compared with sham group; ###, P＜0.001, compared with group I/R

9 电针抑制脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质小胶质细胞数量增加

免疫荧光激光扫描共聚焦显微镜观察发现，假手术组小胶质细胞很少，几乎都处于静息分支状态；再灌注后24h，模型组缺血侧大脑皮质小胶质细胞数量明显增多，细胞胞体明显增大;电针治疗可明显减少激活状态的Iba-1免疫反应阳性小胶质细胞（图5）。

图5电针对脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质小胶质细胞Iba-1免疫阳性反应的荧光检测。比例尺，50μmFig. 5 Immuno fl uorescence examination for the effect of electroacupuncture on microglial in ischemic cerebral cortex of I/R rats. Scale bar, 50μm

讨 论

缺血性脑卒中是中枢神经系统常见的脑血管疾病之一，减轻脑缺血/再灌注后的炎症级联反应是治疗缺血性脑卒中的重要难题。研究表明，细胞内NOD样受体在机体固有免疫及炎症反应中发挥着重要作用，NLRP3炎性小体作为一种多蛋白复合体，是当前研究较热的NOD样受体家族成员。NLRP3炎性小体由NLRP3、衔接蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）和前体caspase-1组成，激活的caspase-1可裂解IL-1β和IL-18前体，产生成熟的IL-1β和IL-18，从而募集中性粒细胞和小胶质细胞等免疫细胞，介导组织炎性损伤[12]，参与机体免疫、动脉粥样硬化、心肌缺血/再灌注损伤、脑缺血/再灌注损伤、阿尔兹海默病等多个疾病[24-26]。Fann等[4,7]通过体内外实验证实，脑缺血/再灌注损伤后，脑内NLRP3炎症小体被激活，促炎因子IL-1β和IL-18等表达上调；NLRP3基因敲除小鼠脑内caspase-3、IL-1β和IL-18表达明显降低，采用Caspase-1抑制剂可阻断脑内神经元损伤，提示NLRP3炎症小体参与了脑缺血/再灌注炎性损伤。Zhang N等[5]研究亦证实，脑缺血/再灌注损伤后脑内NLRP3、ASC和caspase-1表达上调，大黄酚治疗可通过抑制NLRP3炎症小体激活从而发挥脑保护作用。易敏等[27]研究进一步发现，NLRP3炎症小体主要通过促进促炎因子分泌和诱导神经元凋亡从而加重脑再灌注损伤。

对NLRP3小体激活的机制研究发现，P2X7R是NLRP3炎性小体激活的关键调节因子[15,28]。P2X7R作为一种配体门控离子通道，可感受内源性或外源性刺激下细胞外的高浓度ATP，激活的P2X7R可致细胞内钾离子外流增多，从而激活NLRP3炎症小体。P2X7R在缺血性脑卒中病理发展中发挥着重要作用[29-30]。Arbeloa[29]和Lammer[30]等发现，阻断P2X7R作用，可减少脑梗死体积，改善神经功能缺损症状。Feng L等[28]研究表明，在蛛网膜下腔出血模型中，采用SiRNA阻断P2X7R作用，可通过削弱NLRP3炎症小体激活， 减少IL-1β、IL-18和髓过氧化物酶等分泌发挥脑保护作用。

小胶质细胞作为中枢神经系统主要的免疫细胞，在脑缺血缺氧损伤后可迅速参与调节炎症反应。研究表明，P2X7R/NLRP3途经可调节小胶质细胞介导的炎症反应。Ye X等[31]发现，脑出血损伤时小胶质细胞内NLRP3炎症小体明显激活。Yang F等[4]研究表明，NLRP3基因敲除的小鼠，脑内激活状态的小胶质细胞数量明显减少，提示NLRP3可介导小胶质细胞激活。Gustin A等[32]发现NLRP3小体主要在脑内小胶质细胞表达和发挥作用，不能调节星形胶质细胞发挥作用。Chu K等[33]发现，抑制P2X7R表达，可降低NLRP3表达，提高全脑缺血/再灌注大鼠存活率和学习记忆，减少激活状态的小胶质细胞和促炎因子分泌。

大量研究表明，针刺抗炎治疗对临床更有效地防治脑血管疾病具有重要的理论基础和应用价值。研究表明，电针预处理可减少脑内神经元NLRP3、caspase-1和IL-1β表达[34]，也可抑制炎症小体激活[35]。电针治疗对局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内P2X7R的影响目前尚无相关报道。本研究在探讨电针对P2X7R表达变化的同时，将P2X7R、NLRP3同时进行研究，探讨电针治疗对P2X7R/NLRP3信号途经的影响。既往研究表明，脑缺血/再灌注早期脑内小胶质细胞可通过P2X7R/NLRP3信号途经调控炎症反应，而缺血再灌注后24小时，往往是炎症发生、小胶质细胞活化的高峰期，故本研究采用24h作为研究的时间点，探讨电针干预对脑内P2X7R/NLRP3和小胶质细胞激活的影响。

本研究结果显示，局灶脑缺血/再灌模损伤后24h，大脑缺血皮质区P2X7R、NLRP3表达显著增多，该趋势与既往研究一致。而电针治疗后，脑内P2X7R、NLRP3蛋白和mRNA表达显著降低，激活状态的小胶质细胞数量减少。虽然前期研究表明，P2X7R/NLRP3参与调节脑缺血/再灌注早期小胶质细胞介导的炎症反应，但是电针能否通过P2X7R/NLRP3信号途经减弱小胶质细胞激活，这是我们下一步需要进一步探讨明确的。

[1] Donnan GA, Fisher M, Macleod M, et al. Stroke. Lancet,2008, 71(9624): 1612-1623.

[2] Jin R, Liu L, Zhang S, et al. Role of in fl ammation and its mediators in acute ischemic stroke. J Cardiovasc Transl Res.2013, 6(5): 834-851.

[3] Muri KW, Tyrrell P, Sattar N, et al. Inflammation and ischemic stroke. Curr Opin Neurol, 2007, 20(3): 334-342.

[4] Yang F, Wang ZY, Wei XB, et al. NLRP3 de fi ciency ameliorates neurovascular damage in experimental ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab, 2014, 34(4): 660-667.

[5] Zhang N, Zhang X, Liu X, et al. Chrysophanol inhibits NALP3 in fl ammasome activation and ameliorates cerebral ischemia/reperfusion in mice. Mediators Inflamm, 2014:370530.

[6] Wang X, Li R, Wang X, et al. Umbelliferone ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury via upregulating the PPAR gamma expression and suppressing TXNIP/NLRP3 in fl ammasome. Neurosci Lett, 2015 23(600): 182-187.

[7] Fann DY, Lee SY, Manzanero S. Intravenous immunoglobulin suppresses NLRP1 and NLRP3 in fl ammasome-mediated neuronal death in ischemic stroke. Cell Death Dis, 2013,5(4): e790.

[8] Ito M, Shichita T, Okada M, et al. Bruton’s tyrosine kinase is essential for NLRP3 inflammasome activation and contributes to ischaemic brain injury. Nat Commun, 2015,10(6): 7360.

[9] Marquez de Prado B, Hammond DL, Russo AF. Genetic enhancement of calcitonin gene-related peptide-induced central sensitization to mechanical stimuli in mice. J Pain,2009, 10(9): 992-1000.

[10] Orellana JA, Sáez PJ, Shoji KF, et al. Modulation of brain hemichannels and gap junction channels by pro-in fl ammatory agents and their possible role in neurodegeneration. Antioxid Redox Signal, 2009, 11(2): 369-99.

[11] Burnstock G. Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission. Physiol Rev, 2007, 87(2): 659-797

[12] Melani A, Turchi D, Vannucchi MG, et al. ATP extracellular concentrations are increased in the rat striatum during in vivo ischemia. Neurochem Int, 2005, 47(6): 442-448.

[13] Melani A, Corti F, Stephan H, et al. ATP and adenosine release under physiological and ischemic in vivo conditions in the rat striatum. Exp Neurol, 2012, 233(1):193-204.

[14] Feng L, Chen Y, Ding R, et al. P2X7R blockade prevents NLRP3 in fl ammasome activation and brain injury in a rat model of intracerebral hemorrhage: involvement of peroxynitrite. J Neuroin fl ammation, 2016, 13(1):186.

[15] Di Virgilio F. Liaisons dangereuses: P2X(7) and the in fl ammasome. Trends Pharmacol Sci, 2007, 28(9): 465-72.

[16] Eisenbarth SC, Flavell RA. Innate instruction of adaptive immunity revisited: the inflammasome. EMBO Mol Med 2009, 1(2): 92–98.

[17] Sundal C. Microglia: multiple roles in surveillance, circuit shaping, and response to injury. Neurology, 2014,82(20): 1846.

[18] Xu H, Zhang Y, Sun H. Effects of acupuncture at GV20 and ST36 on the expression of matrix metalloproteinase 2,aquaporin 4, and aquaporin 9 in rats subjected to cerebral ischemia/reperfusion injury. PLoS One, 2014, 9(5): e97488.

[19] Han B, Lu Y, Zhao H, Electroacupuncture modulated the inflammatory reaction in MCAO rats via inhibiting the TLR4/NF-κB signaling pathway in microglia. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(9): 11199-205.

[20] Liu L, Cheung RT. Effects of pretreatment with a combination of melatonin and electroacupuncture in a rat model of transient focal cerebral ischemia. Evid Based Complement Alternat Med, 2013: 953162.

[21] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke, 1989, 20(1): 84-91.

[22] Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al． Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination．Stroke, 1986, 17(3): 472 -476．

[23] Latz E, Xiao TS, Stutz A. Activation and regulation of the in fl ammasomes. Nat Rev Immunol, 2013, 13(6): 397-411.

[24] Duewell P, Kono H, Rayner KJ, et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature, 2010, 464(7293): 1357-1361.

[25] Grundmann S, Bode C, Moser M. In fl ammasome activation in reperfusion injury: Friendly fi re on myocardial infarction?Circulation, 2011, 123(6): 574-576

[26] Halle A, Hornung V, Petzold GC, et al. The NALP3 in fl ammasome is involved in the innate immune response to amyloidbeta. Nat Immunol, 2008, 9(8): 857-865.

[27] 易敏，高荔，庞博，等. NLRP3炎性体较重小鼠脑缺血再灌注损失的机制探讨. 山东医药，2014，54（25）：7-9.

[28] Feng L, Chen Y, Ding R, et al. 2015. P2X7R blockade prevents NLRP3 in fl ammasome activation and brain injury in a rat model of intracerebral hemorrhage: involvement of peroxynitrite. J Neuroin fl ammation, 2015, 17(12): 190

[29] Arbeloa J, Perez-Samartin A, Gottlieb M, et al. P2X7 receptor blockade prevents ATP excitotoxicity in neurons and reduces brain damage after ischemia. Neurobiol Dis, 2012,45(3): 954-961.

[30] Lammer AB, Beck A, Grummich B, et al. The P2 receptor antagonist PPADS supports recovery from experimental stroke in vivo. PLoS One, 2011, 6(5): e19983.

[31] Ye X, Zuo D, Yu L. ROS/TXNIP pathway contributes to thrombin induced NLRP3 inflammasome activation and cell apoptosis in microglia. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 485(2): 499-505.

[32] Gustin A1, Kirchmeyer M1, Koncina E. NLRP3 in fl ammasome is expressed and functional in mouse brain microglia but not in astrocytes. PLoS One, 2015, 10(6): e0130624.

[33] Chu K, Yin B, Wang J, et al. Inhibition of P2X7 receptor ameliorates transient global cerebral ischemia/reperfusion injury via modulating in fl ammatory responses in the rat hippocampus. J Neuroin fl ammation, 2012, 18(9): 69.

[34] 何宇航，王强，江涛. 电针预处理对大鼠脑缺血再灌注时神经元NLRP3表达的影响. 中华麻醉学杂志，2016，36（3）：358-361.

[35] Gao F, Xiang HC, Li HP, et al. Electroacupuncture inhibits NLRP3 in fl ammasome activation through CB2 receptors in in fl ammatory pain. Brain Behav Immun, 2018, 67: 91-100.