中华鳖冬眠后精子发生及肌酸激酶的表达规律

胡怡琦，楼佳栋，潘文洁，金歆怡，卢建良，钱国英*，王伟*

（1浙江万里学院生物与环境学院，浙江省重中之重学科实验室，宁波 315100；2浙江理工大学生命科学学院，杭州310018）

中华鳖（Pelodiscus sinensis）是爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属的代表动物之一，具有季节性生殖周期[1]。中华鳖是具有冬眠习性的爬行动物，精子的发生也具有明显的季节性。研究表明雄性和雌性的生殖周期并不同步，在一年的不同时期分别产生雌雄配子[2]。前期的研究表明雄性精子发生始于4、5月份，在8、9月份时正处于高峰期，直至11月末停止，然后精子一次性释放到附睾中储存起来[3]。但是冬眠期是否就是精子发生的静止期，冬眠期是否存在着精子释放尚不清楚。

肌酸激酶（creatine kinase，CK）是胍基磷酸转移酶家族的一员，在ATP能量快速转移方面发挥着重要的作用[4-7]。CK主要定位于ATP快速再生的细胞中，主要参与离子泵转运、磷酸肌酸穿梭、肌肉收缩、ATP再生、吞噬细胞吞噬、糖酵解调控以及神经递质的释放[8-10]。精子中能量的利用和生成是密切偶联的，CK可催化肌酸（creatine）和腺苷三磷酸（ATP）生成磷酸肌酸（CP）和腺苷二磷酸（ADP）的可逆反应，为细胞提供及时的能量储存，是精子能量合成及运输的关键酶[11]。但是，CK与中华鳖精子发生的关系鲜有报道。研究冬眠前后CK在中华鳖睾丸曲细精管中的表达定位，对于研究中华鳖精子发生的能量供应具有积极的意义。

本研究以9月、12月和来年3月的性成熟中华鳖为研究对象，对曲细精管生精上皮的组织形态学进行分析，探讨精子发生和释放的规律。同时，采用免疫组织化学方法分析CK在冬眠前后的组织表达规律，探讨CK在精子发生中的作用。

材料与方法

1 实验动物处理及样品采集

性成熟雄性中华鳖购自浙江余姚某水产养殖场。分别于当年9月、12月和第二年3月进行取样，每个时间点各取3只。其中12月份和3月份为冬眠期样品，在室外水族箱中完成自然冬眠。中华鳖屠宰后取睾丸组织，切成约5mm见方的小块，在4%多聚甲醛中固定24h后用于组织学分析。

2 石蜡切片制作及HE染色

将固定后的睾丸组织经过梯度乙醇脱水处理，在透明和浸蜡后进行石蜡组织包埋。修块后进行7 μm组织切片（RM 2125，徕卡，德国），并于40°C水浴中进行摊片和展片；随后用APES处理后的载玻片进行捞片，并在烤片机上烘干12h（40°C）。进行常规HE染色（无毒环保苏木素-伊红（H-E）染液D006，南京建成生物，中国），最后用中性树胶封片进行观察。

3 CK的免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡、止水后，经过3% H2O2甲醇-PBS溶液消除内源性过氧化物酶活性，用0.01mol/L枸橼酸缓冲液（pH6.0）进行抗原热修复后用5% BSA进行封闭，随后滴加生物素化山羊抗兔IgG一抗，具体 为 CK-B（ab151579，Abcam，USA，1:200），CK-M（ab151465，Abcam，USA，1:200），CK-S（ab189314，Abcam, USA，1:250）。孵育后进行SABC反应（SA1022，博士德，中国），DAB显色后用显微成像系统进行观察。

结 果

1 冬眠前后精子发生的显微结构特点

通过比较冬眠前后精子发生的情况，我们发现9月份睾丸曲细精管上皮细胞包含大量的初级精母细胞和精子细胞，大量发育中的精子在管腔中呈“穗状”排列（图1A-1C）。12月份睾丸曲细精管中，几乎不见初级精母细胞，但是管腔中还存在大量的精子，以及正在发生变形的精子（图1D）。在3月份的睾丸曲细精管中，管腔中存在少量的精子，几乎不见初级精母细胞和变形中的精子（图1E）；但是在曲细精管之间交界的基质处，精原细胞和初级精母细胞数量已开始增多（图1F）。

图1 中华鳖冬眠后的精子发生。A-C，9月份睾丸曲细精管，大量发育中的精子呈“穗状”排列；D，12月份睾丸曲细精管，管腔中存在大量的精子，及正在变形的精子（红色圆圈中标示）；E和F，3月份的睾丸曲细精管，管腔中存在少量的精子，图F可见靠近基质部分的精原细胞和初级精母细胞数量开始增多；L，管腔；SC，支持细胞；S，精原细胞；PS，初级精母细胞；SS，次级精母细胞；Sd，精子细胞；Sz，精子；比例尺：A, 75μm; B-F, 25μmFig.1 Spermatogenesis of Pelodiscus sinensis after hibernation. A to C, a large amount of developing sperms were arranged in spike-like pattern in seminiferous tubule of testis collected in September; D, in December samples, there were lots of sperm and some metamorphic sperms (marked by the red circle) in the lumen of seminiferous tubule; E and F, a small number of sperms existed in the lumen of seminiferous tubule collected in next March;F, the number of spermatogonia and primary spermatocytes near stroma began to increase; L, lumen; SC, sertoli cell; S, spermatogonia; PS, primary spermatocytes; SS, secondary spermatocyte; Sd, spermartid; Sz, spermatozoon; scale bar, 75μm in A and 25μm in B to F

2 冬眠前后睾丸中CKs表达特点

免疫组织化学结果显示，CKs在不同月份的睾丸中的表达定位不同。在9月份的睾丸中（图2A-2C），精子发生处于活跃期，CK-S在曲细精管上皮细胞中广泛大量表达，而CK-B只是微量表达；CKM的表达主要在精原细胞和初级精母细胞。在12月份的睾丸中（图2D-2F），精子发生基本处于停滞阶段，CK-B主要在精原细胞内表达；而CK-M的表达主要集中在精原细胞内及胞外，同时在管腔中也有表达；值得注意的是，CK-S的表达虽具有广泛性，但是在充满精子的管腔中表达量很高。在3月的睾丸中（图2G-2I），3种CK亚型的表达方式和12月份相似，但是管腔内的精子数量显著减少。因此，CK亚型在不同月份中也表现出不同的表达方式。CK-B和CK-M在冬眠后主要在精原细胞中表达，而CKM和CK-S在胞外和曲细精管管腔中也大量表达。

图2不同CK亚型在曲细精管中的表达定位分析。A-C，在9月份CK-M和CK-S在曲细精管中广泛大量表达；D-F，在12月份的精母细胞中三种亚型的CK均大量表达，在曲细精管的管腔中可见大量正在变形的精子（红色圆圈内）；G-I，3月份的曲细精管上皮细胞，三种CK亚型的表达方式和12月份相似；S，精原细胞；PS，初级精母细胞；SS，次级精母细胞；Sd，精子细胞；Sz，精子）；比例尺，25μmFig. 2 Localization and tissue expression analysis of CKs. A to C, in September, CK-M & S were extensively expressed in the seminiferous tubule; D to F, in December, all three CKs were extensively expressed in spermatocyte cells, and many metamorphic sperm cells were observed (marked by the red circle); G to I, in March, the patterns of CKs expression were similar to December; S, spermatogonia; PS, primary spermatocytes; SS, secondary spermatocyte; Sd, spermartid; Sz, spermatozoon; scale bar, 25μm

讨 论

在中华鳖冬眠前的9月份，生精上皮的精子发生非常活跃，曲细精管内可见大量发育中的精子呈“穗状”排列。而到了冬眠期，精子发生趋于静止，不仅“穗状”排列的精子消失，曲细精管内也鲜有精母细胞存在。但是冬眠期的精子发生并不是完全停止的—12月份的曲细精管内含有大量的精子，生精上皮内还存在处于变形阶段的精子；而到了3月份，曲细精管内仅有少量的精子存在，且处于变形阶段的精子几乎看不到。因此，中华鳖冬眠后精子的发生并不是完全停止的。虽然这与Zhang等[12]所描述的不完全一致，但是冬眠期精子的发生还是趋于静止的状态，精母细胞的数量也变得稀少。

关于中华鳖精子释放的方式，通常认为是在冬眠前一次性排放到附睾中。但是，我们观察到从12月份到来年的3月份，不仅仅是发育中的精子数量在减少，曲细精管内游离的精子数量也在减少。如果说精子的释放每年只有一次，那么就不会出现精子数量减少的情况。根据这个现象，我们推测精子的释放方式可能是一年多次的，即使是处于冬眠阶段。

能量代谢关键基因CKs的免疫组化结果显示，CKs在生精上皮中广泛和大量表达，且不同亚型的

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