二氧化铈纳米颗粒预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞Nrf2信号通路的影响

黄真锋，法宪恩，朱方涛，王宏山，高成山，柳　兵

1)郑州大学第二附属医院心脏大血管外科 郑州 450014　2)郑州市第七人民医院心脏大血管外科 郑州 450000

缺血再灌注除可引起心肌缺血损伤，还可引起超微结构、代谢、功能和电生理方面的一系列损伤,称为缺血-再灌注(ischemia-reperfusion, IR)损伤[1]。既往研究[2]显示，二氧化铈纳米颗粒(nanoceria)预处理能减轻大鼠IR心肌的氧化应激损伤反应，表现出较好的心肌保护效果。本研究旨在从基因和蛋白水平研究nanoceria对核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、相关基因醌氧化还原酶1(NQO1)及血红素氧化酶1(HO-1)表达的影响， 探讨其心肌保护作用的可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物和主要材料健康成年雄性SD大鼠50只，购自河南省实验动物中心，体重250～280 g，根据郑州大学动物伦理要求处理实验动物。RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，抗大鼠Nrf2单抗购自Abcam公司，RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物技术公司。1～10 nm粒径nanoceria购自美国Sciventions公司(批号191CO)，10～25 nm粒径nanoceria购自美国Sigma公司(批号554841)，50 nm粒径nanoceria购自北京纳辰科技发展有限责任公司(批号NP422-1)。

1.2实验分组将50只SD大鼠随机分组：假手术组、模型组、nanoceria预处理1～3组，每组10只。模型组：参考吕瑞涛等[2]方法建立心肌IR大鼠模型，心肌缺血45 min末剪断结扎线取出乳胶小管，恢复冠状动脉血流，缺血部位心肌颜色恢复为模型成功，再灌注时长为120 min。nanoceria预处理1～3组：分别将1～10、10～25和50 nm粒径的nanoceria溶解于PBS缓冲液中，配制成1 g/L的悬液,于术前24 h经尾静脉注射(2 mL/kg)，其余步骤同模型组。假手术组：大鼠术前24 h经尾静脉注入PBS缓冲液(2 mL/kg)；术中开胸后，于心脏左前降支处只穿线，不结扎冠状动脉，其余操作同模型组。

1.3标本采集再灌注结束后取出大鼠心脏并立即置于4 ℃生理盐水中，排净心腔中血液，剪取左前降支结扎线远端再灌注区位置的心肌组织，快速放入-80 ℃冰箱中保存。

1.4心肌组织中Nrf2、NQO1、HO-1mRNA的检测按照试剂说明，Trizol法提取标本心肌组织中的总RNA，并用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定,用反转录试剂盒合成cDNA。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Nrf2引物序列：正义链为5’-CACTCTGTGGAGTCTTCCA-3’,反义链为5’-GAATGTGTTGGCTGTGCTTTA-3’；NQO1：正义链为5’-GTGGTCGAATCTGACCTCTA-3’，反义链为5’-GAATCCTGCCTGGAAGTTTA-3’；HO-1：正义链为5’-GGAGATAGAGCGAAACAAGCAGAA-3’，反义链为5’-CACGGTCGCCAACAGGAAA-3’；β-actin：正义链为5’-CATCCTGCGTCTGGACCT-3’，反义链为5’-TCAG GAGGAGCAATGATCTTG-3’。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共30个循环。产物于15 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用全自动凝胶成像及分析系统分析，用2-ΔΔCt法计算目的mRNA的表达水平。

1.5心肌细胞核内Nrf2蛋白的检测采用Western blot法检测。用EDTA处理心肌细胞，PBS清洗2次，用细胞核蛋白抽提试剂盒按说明书抽提心肌细胞核蛋白。制备SDS-PAGE 凝胶，转膜后上样胞核蛋白，检测其中Nrf2蛋白的表达量，用图像软件分析目的条带光密度，以目的条带与对照光密度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.6统计学处理应用SPSS 21.0分析数据，5组心肌组织中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA及Nrf2蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1大鼠心肌组织中Nrf2、HO-1、NQO1mRNA的表达见表1。模型组HO-1、NQO1 mRNA的表达水平较假手术组升高，而Nrf2 mRNA表达水平两组无明显差异。Nanoceria预处理组Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表达水平均较模型组升高，其中Nanoceria预处理2组表达水平最高。

2.2大鼠心肌细胞胞核内Nrf2蛋白的表达具体见表1。模型组心肌细胞胞核内Nrf2蛋白表达较假手术组升高。Nanoceria预处理组心肌细胞胞核内Nrf2蛋白表达均较模型组升高，其中Nanoceria预处理2组表达水平最高。

表1　大鼠心肌组织内Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA及胞核内Nrf2蛋白的表达

*：与假手术组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05；△：与Nanoceria预处理2组比较，P<0.05

3　讨论

随着冠状动脉溶栓术、经皮冠脉支架植入术、冠状动脉搭桥术及心脏移植手术等的广泛开展,IR损伤成为影响治疗效果的重要因素之一。钙超载、氧自由基、细胞凋亡、心肌能量代谢障碍等均参与了IR损伤过程，导致临床并发症的增加。Nanoceria作为一种新型纳米材料，具有粒径相对较小而比表面积较大的特点，其表面有较多的氧空位[3-4]，这使其更容易参加氧化还原过程，从而具有一定的再生自由基清除潜力[5-6]。有研究[7-9]结果显示，Nanoceria能直接清除O2、HO等自由基，使细胞免于脂质过氧化反应和自由基反应引起的损伤，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用。本课题组前期研究[2]已证实，对于IR损伤大鼠，Nanoceria预处理可提高其心肌组织中超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量，减轻IR中的氧化应激损伤，有心肌保护作用，但其通过何种机制发挥这一作用尚待进一步研究。

Nrf2是调控氧化应激表达的重要基因，可与抗氧化基因上游启动子区的抗氧化反应元件相结合，诱导一系列内源性的抗氧化蛋白、抗氧化酶、抗炎等细胞保护基因表达上调，如调控醌氧化还原酶、血红素氧化酶等的表达，维持细胞的氧化抗氧化平衡状态[10-11]。本研究结果显示，Nanoceria预处理能上调大鼠再灌注心肌中Nrf2表达量，使其下游相关细胞保护性基因NQO1、HO-1表达明显增加，减轻再灌注心肌的氧化损伤，从而发挥保护心肌的作用。

在正常生理状态下，Nrf2主要表达于细胞质，而当发生氧化应激或受到其他因素诱导后，Nrf2可通过磷酸化与Kelch相关蛋白1解偶联而进入胞核内，激活依赖Nrf2的基因转录信号通路。本研究结果显示，经IR应激诱导后，心肌细胞胞核内Nrf2蛋白表达水平明显上升。Nanoceria预处理组Nrf2蛋白表达较模型组明显上升。这说明Nanoceria预处理可增加Nrf2蛋白的表达水平，促使其核内转移。

综上所述，在大鼠IR损伤中，Nanoceria可作为一种新型的Nrf2诱导物激活Nrf2信号通路，使Nrf2蛋白和相关基因HO-1、NQO1表达升高，并发生Nrf2核内转移，从而达到保护IR损伤心肌的目的。

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