沉默S100P对膀胱癌5637细胞生物学特性的影响

田　鑫，赵　辉，李晓东，李铁强，朱朝阳

1)河南大学淮河医院泌尿外科 河南开封 475000　2)河南大学药学院药学专业实验室 河南开封 475004

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈逐年上升趋势。在我国，男性膀胱癌发病率位居泌尿生殖系恶性肿瘤第一位，居全身肿瘤的第八位[1]。膀胱尿路上皮癌约占90%，其中80%为浅表性癌，可行尿道膀胱肿瘤电切+膀胱灌注化疗治疗，但术后30%～40%肿瘤复发伴有恶性程度增加或向浸润性发展[2-3]。因此，重视膀胱肿瘤的生物学特性，找出膀胱癌易复发、浸润、转移的原因，对于诊断、预防和控制膀胱癌的进展及复发尤为重要。S100P蛋白是EF手型钙结合蛋白S100家族的一个新成员，与多种肿瘤的发生发展关系密切[4]。本研究利用RNAi技术沉默人膀胱癌5637细胞中S100P基因的表达，观察膀胱癌细胞生物学特性及化疗敏感性的变化。

1　材料与方法

1.1细胞及主要试剂5637细胞株和293T细胞均由淮河医院生物实验室保存。pLKO.1-TRC载体购自北京科瑞思博生物科技有限公司，慢病毒载体pLKO.1-TRC-S100P由北京擎科生物技术公司合成，S100P siRNA序列为5’-CTTCAGTGAGTTCATCG TGTT-3’， shRNA正向序列为:5’-CCGGCTTCAGT GAGTTCATCGTGTTCTCGAGAACACGATGAACTCAC TGAAGTTTTTG-3’，反向为5’-AATTCAAAAACT TCAGTGAGTTCATCGTGTTCTCGAGAACACGATGAA CTCACTGAAG-3’。用293T细胞包装慢病毒，制备慢病毒溶液。

1.2实验分组5637细胞常规培养于含体积分数10%胎牛血清的双抗DMEM培养液中。实验分为空白对照组、阴性对照组和S100P siRNA组，其中S100P siRNA组感染含S100P siRNA的慢病毒，阴性对照组感染空病毒，空白对照组不作处理。

1.3观测指标

1.3.1S100P mRNA的检测采用实时荧光定量PCR法检测。病毒感染48 h后，收集细胞提取总RNA，测定RNA浓度和纯度，反转录得cDNA，以β-actin为内参，进行RT-PCR。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，引物由北京擎科生物技术有限公司合成。S100P上游引物序列为5’-TGACGGAACTAGAGACAGCC-3’，下游为5’-GCCACGAACACGATGAACTC-3’；β-actin上游引物序列为5’-CTCACCCTGAAGTACCCCATC-3’，下游为5’-CTTGATCTTCATTGTGCTGGGT-3’。扩增条件：95 ℃30 s变性，60 ℃30 s退火，72 ℃45 s延伸，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt法计算S100P mRNA的相对表达量。

1.3.2S100P及相关蛋白的检测采用Western blot法检测。病毒感染48 h后，收集并裂解细胞，提取总蛋白，采用BCA法测蛋白浓度。分别取40 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，4 ℃封闭过夜，加一抗4 ℃孵育过夜。一抗分别为兔抗S100P单抗(稀释度1500)，Cyclin D1、P53、NF-kB p65、埃兹蛋白(Ezrin)、P-糖蛋白(P-gp)小鼠单抗(稀释度均为11 000)，兔抗人β-actin抗体(稀释度为13 000)，均购自上海Abcam有限公司。加二抗HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG(稀释度12 000)室温孵育1 h，化学发光后显影。采用Image J 2X计算目的条带与内参条带灰度值的比值，即为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.3.3细胞增殖抑制率的检测病毒感染48 h后，将3组细胞分别用2.5 g/L胰酶消化，制成细胞悬液，以每孔104个接种于96孔板，于37 ℃体积分数5% CO2培养箱中培养，分别于培养0、24、48、72 h后，MTT法检测细胞增殖情况，每组每个时间点设6个平行孔。MTT试剂盒购自碧云天生物技术研究所，酶联免疫检测仪检测波长490 nm处的吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(空白对照组A值-实验组A值)/空白对照组A值×100%。实验重复3次。

1.3.4吡柔比星半数抑制浓度(IC50)的测定病毒感染48 h后，将空白对照组和S100P siRNA组细胞用2.5 g/L胰酶消化，制成细胞悬液，以每孔104个接种于96孔板，于37 ℃体积分数5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，分别加吡柔比星1、10、50、100、200 mg/L处理24 h，MTT法测细胞增殖情况，每组每个浓度5孔。以吡柔比星质量浓度为横坐标，以细胞增殖抑制率为纵坐标，绘制细胞增殖抑制曲线，计算IC50。实验重复3次。

1.3.5细胞凋亡率的检测将3组细胞分别接种于6孔板，每组3个复孔，待细胞生长融合度约为90%时，收集细胞，PBS洗涤，制成细胞悬液。加入Annexin V-FITC混匀，室温避光约15 min，上机前5 min加入PI，避光混匀，采用CytoFLEX 流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

2　结果

2.1细胞中S100PmRNA和蛋白的表达情况见图1、表1。可以看出，S100P siRNA组S100P mRNA和蛋白表达水平均较空白对照组和阴性对照组降低，提示S100P siRNA有效沉默了膀胱癌5637细胞中S100P的表达。

2.2细胞增殖抑制率测定结果细胞增殖抑制率的比较见表2。可以看出，S100P siRNA组细胞的增殖抑制率大于阴性对照组，提示沉默S100P可抑制膀胱癌5637细胞的增殖。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：S100P siRNA组图1　3组细胞中S100P蛋白的表达

表1　3组细胞中S100P mRNA和蛋白的表达

*与其他两组比较，P<0.05

表2　S100P siRNA组和阴性对照组细胞增殖抑制率的比较　%

2.3吡柔比星IC50测定结果吡柔比星作用下S100P siRNA组和空白对照组细胞增殖抑制率的比较见表3。吡柔比星处理24 h对S100P siRNA组细胞的IC50为60.04 mg/L，在空白对照组为>200 mg/L，提示沉默S100P能够增强膀胱癌5637细胞对吡柔比星的化疗敏感性。

表3　吡柔比星作用下S100P siRNA组和空白对照组细胞增殖抑制率的比较(n=3)　%

2.43组细胞相关蛋白的表达相关蛋白检测结果见图2、表4。结果提示沉默S100P可下调膀胱癌5637细胞中Cyclin D1、CDK2、P53、NF-kB、Ezrin及P-gp蛋白的表达。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：S100P siRNA组图2　相关蛋白的表达情况

表4　3组细胞相关蛋白的相对表达量

*与空白对照组和阴性对照组相比，P<0.05

2.53组细胞凋亡率的比较S100P siRNA组、空白对照组、阴性对照组细胞凋亡率分别为(21.1±2.8)%、(8.1±1.6)%和(8.3±1.7)%，3组比较差异有统计学意义(F=87.891，P<0.001)，S100P siRNA组高于其他2组(P<0.05)，提示沉默S100P可促进膀胱癌5637细胞凋亡。

3　讨论

膀胱癌的发生发展是一个多基因共同参与调控的复杂过程，而影响膀胱癌发生发展、侵袭和转移过程中的关键节点以及相关基因可成为膀胱癌治疗的新靶点。S100P位于多种细胞的细胞质和细胞核内，参与细胞周期进展和分化等多种生物活动，近年来多项研究[5-9]发现，其在胃癌、胆管癌、乳腺癌及膀胱癌等多种肿瘤组织中表达异常。Higgins等[10]应用cDNA微阵列技术分析发现，S100P与尿路上皮癌的发生发展有关，可用于其诊断及预后评估。韩晓春等[11]发现S100P在膀胱癌组织中高表达，与膀胱癌的发生发展、浸润和转移关系密切。S100P还可能与癌细胞的化疗敏感性有关。过表达S100P能够增强卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性[12]，降低包括膀胱癌在内的多种肿瘤细胞(如胰腺癌细胞Panc-1、结肠癌SW480)对5-氟尿嘧啶的敏感性[13]。本研究应用RNAi技术沉默S100P的表达后，膀胱癌5637细胞的增殖能力减弱，凋亡率增加，对吡柔比星的化疗敏感性增强。由此可以推测S100P在膀胱癌的发生发展中可能具有促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用，并影响细胞对吡柔比星等化疗药物的敏感性。本研究结果还显示，沉默S100P后，膀胱癌5637细胞中细胞周期相关因子Cyclin D1、CDK2，原癌基因P53、NF-κB、Ezrin蛋白和耐药相关的P-gp蛋白的表达也降低。推测S100P可能是通过调控这一系列相关蛋白的表达，影响膀胱癌细胞的增殖、侵袭、转移以及耐药性。

现有研究[14-16]表明S100P可能是通过与钙周期结合蛋白、Ezrin、晚期糖基化终末产物(RAGE)等靶蛋白结合，参与多种信号转导途径，从而调控肿瘤细胞的增殖、浸润和转移。S100P可与细胞周期调节因子Cyclin D1、CDK2协同作用，调节细胞周期，影响癌细胞的增殖[17]；可与RAGE结合，激活NF-κB信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和迁移[18]；其还能够结合P53，使其失活，从而引起DNA损伤，介导细胞异常增殖[19]；在一定的钙离子浓度下，S100P可激活Ezrin蛋白，调节中性粒细胞之间的黏附，促进肿瘤细胞的生长、侵袭和远处转移[20]。

综上所述，S100P的异常表达可能与膀胱癌细胞的增殖、侵袭、转移及化疗疗效关系密切，这为靶向沉默S100P基因治疗膀胱癌提供了一定的理论基础。

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