Cell-SELEX技术为基础的靶向药物递送系统研究进展

宁宇综述；李章华，邹季审校

1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；

2.武汉大学 附属同仁医院（武汉市第三医院），湖北 武汉 430074

指数富集的配体系统进化（systematic evolu⁃tion of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术的发明以Tuerk和Ellington等在体外获得了能与蛋白质或染料等小分子特异结合的RNA片段为标志[1-2]。通过SELEX方式获得的这一类特异性的核苷酸配基被称为适配体（aptamer）。适配体的本质是一段能形成三维空间结构的单链寡核苷酸配基，即RNA或DNA。由于单链RNA的结构在空间上的多变性，可以形成诸如茎环、发夹、口袋等结构，导致其在理论上能与各种靶物质结合。因此在此技术的发展过程中，由最初的核酸结合蛋白等发展到包括活细胞、核酸、多肽类、病毒甚至金属离子等[3-4]。与抗体相比，适配体的特异性更高，同时其能够耐受相应的温度、pH值变化，稳定性较高。并且适配体可以完全通过体外获得，能够根据实际需要进行修饰与组装，成本时长较抗体而言大为降低。因此，SELEX技术在靶向药物、生物基础研究、医疗临床方面得到广泛应用。2004年，美国食品药品管理局（FDA）批准适配体培加他尼（pegatanib，商品名Macugen）用于治疗湿性老年黄斑变性（AMD），标志着SELEX在临床治疗中得到正式应用[5]。

1 Cell-SELEX技术

肿瘤等疾病的治疗在很大程度上取决于患病部位的药物浓度，而适配体与目的细胞的特异性结合，给肿瘤等疾病的治疗提供了新的方向。其总体思路是将各种目的细胞的适配子与相应的药物和材料结合，使药物和材料通过与适配子在相应部位聚集，进入或者与相应细胞连接，从而达到治疗疾病的目的。目前已有多种物质通过这种药物递送系统进入细胞。适配体在靶向药物材料方面应用，主要通过筛选活的目的细胞而实现。

1.1 Cell-SELEX技术的特点

活细胞的适配子筛选方式被称为Cell-SELEX技术，即以活的目的细胞为靶物质，获取能与特定目的细胞相结合的适配体的技术。在传统的SELEX技术中，须首先明确并纯化靶细胞上的膜蛋白，然后通过与膜蛋白的结合来筛选相应的适配体。但由于膜蛋白在体外扩增重组无法形成生理状态下正常的三维结构，导致体外无法获得大量高纯度的膜蛋白，同时筛选出的适配体的特异性也并不理想，因而限制了这一技术的发展[6]。而Cell-SELEX技术无须预先对细胞膜蛋白进行研究，也无须明确适配体与细胞上具体膜蛋白的种类和位点。由于适配子自身的特异性，可通过洗涤和离心提取结合物，从而无须固定和提纯所需蛋白，解决了靶蛋白纯化的难题[7]。

同时，Cell-SELEX技术不仅能特异结合相应靶细胞，也能分辨细胞表面生物标记物，从而将同源细胞进行分离。Berezovski等[8]运用核酸适配体促进的生物标记物发现技术（AptaBiD）区别成熟与未成熟的树突状细胞上的生物标记物，不仅获得了合成亲和力的适配体探针，并且发现了其生物标记物，获得的适配体能够同时用于细胞分离、可视化及细胞的体内追踪。Jiang等[9]利用适配体证实了膜蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）作为诊断白血病的生物标志物的可行性。Ara等[10]构建了小鼠原代肿瘤内皮细胞（mTECs）的适配体AraHH001，通过AptaBiD技术，将适配体与mTECs结合后进行提纯分离，发现AraHH001能结合mTECs上的肌钙蛋白T，从而获得了mTECs的新生物标记物肌钙蛋白T，从而为限制肿瘤血管生长提供了新的诊断治疗工具。

1.2 Cell-SELEX技术的筛选方法

Cell-SELEX技术的筛选方式与传统的蛋白类核酸适配体筛选方式相似。①首先合成一个随机的寡核苷酸ssDNA文库，中间包括25～30个随机排列的碱基，随机区域的长度由合成效率和制备的难易度所决定；②将目的细胞与合成的随机ssDNA文库共同孵育；③洗涤未结合的文库并通过离心等方式洗脱，获得亲和力强的ssDNA；④将目的细胞的同源细胞与筛选出的ssDNA文库孵育，消减能够共同识别2种同源细胞的适配体；⑤去除亲和力低的ssDNA文库，获取的亲和力较高的文库通过PCR等技术扩增，形成下一轮扩增的次级文库，重复上述步骤。经过10～15轮的筛选过程，直到获取的文库亲和力不再明显增强。然后选取这些特异性高的文库进行鉴定和扩增，即获得所需目的细胞的适配体。

一些条件对筛选结果有较大影响。如目的细胞的状态，在与寡核苷酸文库的孵育中，细胞的过度生长和死细胞都会影响筛选的成功率，并且贴壁细胞应用胰蛋白酶或非蛋白酶消化试剂后，都会影响其表面形态表达[11]。Souza等[12]利用磁悬浮技术（magnetic levitation method，MLM）对细胞进行悬浮培养，产生的球形悬浮细胞比传统的贴壁培养的前列腺肿瘤细胞表面蛋白更能够均匀地与适配体接触，从而获得纳摩尔级别解离常数亲和力的适配体。

寡核苷酸ssDNA文库对于适配体的筛选也同样重要。自上世纪90年代初Switzer等发现了DNA或RNA中增加非自然碱基的可能性之后。Kimoto 等[13]将一个第五碱基 7-（2-thienyl）imidazo［4，5-b］ pyridine（Ds）加入随机文库，构建人血管内皮细胞因子（VEDF-165）和干扰素（IFN-γ）的DNA适配子，结果表明其特异性较自然碱基文库的适配子提高100倍。Zhang等[14]构建了2个严格按照Watson-Crick几何形态配对的新核苷酸来构建能特异性结合肝癌细胞的适配体的随机文库，这个基于所谓的GACTAP文库所筛选出的具有Z和P碱基的6核酸DNA适配体的亲和力较自然碱基组成的适配体更高。提示具有非自然碱基的核苷酸文库有着更好的生物功能性。

除体外孵育之外，有学者通过将文库注射入动物体内，直接在体内将文库与靶细胞孵育，取出目的组织细胞后洗脱扩增获得次级文库，从而获得生理状态下的特异细胞适配体，避免了体外筛选孵育可能出现的潜在问题[15]。

2 结合适配体的靶向药物递送系统

由于适配体能够与靶细胞特异结合，通过对适配体的修饰和连接，能够应用于诸如药物递送、疾病诊断、生物成像、分子探针等领域。对很多疾病来说，药物分子在目标部位的富集和药物毒副作用的降低，是药物递送系统的发展方向。适配体作为分子靶向药物递送系统的新工具，具有半衰期短、分子小、成本较低、性质稳定等特点。通过Cell-SELEX技术筛选出来的各种细胞特异的适配体通过各种方式与不同的药物或材料连接后，能够特异递送药物分子到相应靶细胞，从而达到诊断治疗疾病的目的。

2.1 适配体的药物样作用

某些适配体能与细胞表面的特异蛋白结合，从而影响细胞的信号传递。依据这一原理，适配体能够直接作用于靶细胞，抑制靶细胞的生长，本质上具有药物的作用。Ohuchi等[16]运用TECSSELEX技术筛选出一个RNA适配体，能够与CHO细胞膜表面的TGF-βⅢ受体结合，抑制CHO的生长。培加他尼作为第一种进入临床试验的适配体药物，其原理即是能特异结合黄斑变性细胞表面的主要表型VEDF-165，抑制其与受体Flt-1和KDR的结合，从而减少病变组织内的血管形成，延缓病变的发展。

2.2 适配体与药物连接

适配体与药物的直接连接一般通过共价键或非共价键（即将药物分子嵌入适配体内）实现。药物与适配体的共价键一般较为牢固，通常是将适配体末端修饰的氨基与药物经过化学修饰产生的羟基、羧基等结合，形成共价键，达到连接的目的。Huang等[17]将肿瘤药物阿霉素（doxoru⁃bicin，Dox）与人急性T细胞型淋巴母细胞白血病细胞的表面酪氨酸蛋白激酶7（PTK7）的DNA适配体sgc8c通过共价键连接。由于sgc8c与目标蛋白PTK7结合后可以内化进入细胞，通过共聚焦显微镜观察，2 h后Dox在细胞内均匀分布，表明细胞内涵体的酸性环境能够切割复合物的共价连接，使Dox进入细胞核内并发挥作用。其缺点在于适配体与药物的低结合比率。

由于蒽环的存在，Dox能够通过非共价键直接嵌入DNA链。Meng等[18]利用Dox的这一特性，将LH86细胞（人肝癌细胞）特异性DNA适配体TLS11a与Dox结合，通过修饰适配体TLS11a，将一个GC尾加到TLS11a的5′端，形成TLS11a-GC，从而形成一种二聚体结构。最终形成的TLS11a-GC适配体与Dox结合后的理论比例达到1∶28，其实际比例维持在1∶25的高水平。同时还构建了诸如自组装双特异性适配体药物递送系统sgc8csgd5a（SD），在混合细胞系中对不同亚型的肿瘤细胞均可特异识别。通过这种连接方式，适配体不仅能够作为靶向结构，同时也能成为运载结构，表明这种结构在药物递送中载药量方面具有巨大优势[19]。

2.3 适配体与纳米材料连接

适配体与不同的纳米材料结合，在发挥适配体靶向结合作用的基础上，利用纳米材料能够装载大量药物分子、产生活性氧，或者某些纳米材料能够同时结合不同极性药物的特性从而实现不同的目的。

金纳米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）具有很多优良性能[20]，如：①AuNPs性质稳定、无毒，同时具有良好的生物相容性；②AuNPs的粒子大小可进行随意控制（1～150 nm），匹配所连接的生物分子；③纳米粒子具有高表面面积体积比，能够提供大量生物分子结合位点。这些优点决定了AuNPs成为药物递送系统中的理想材料。Shiao等[21]通过组装13 nm的AuNPs，将其与具有21个碱基对的适配体AS1411连接，同时将光敏剂TMPyP4及化疗药物阿霉素Dox通过物理方式连接到纳米金适配体复合物上。通过适配体的靶向性，将这个复合物递送到靶细胞HeLa或耐阿霉素MCF-7R细胞中，经过632 nm的光照后，TMP⁃yP4诱导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）毒性和释放的Dox同时对细胞产生损伤。这种复合给药方式被证明比单独给药更为优异。

氧化锌纳米粒子（ZnO NPs）作为一种新兴的纳米材料，在经过表面修饰后能释放抗肿瘤药物，同时由于肿瘤细胞的酸性环境，ZnO不仅能够分解产生ROS杀伤肿瘤细胞，并且二价锌Zn2+也能够对肿瘤产生治疗作用。将乳腺癌细胞表面蛋白MUC1的适配体S2.2与ZnO NPs结合，将Dox嵌入适配体组成复合物，适配体功能化的ZnO NPs能够特异结合靶细胞，在紫外线照射下，细胞存活率由64%下降到42%，从而使靶向光催化疗法和化疗方法的治疗效果叠加[22]。

此外还有一种金属纳米材料，即超顺磁性氧化铁纳米粒子（superparamagneticironoxide nanoparticles，SPION）。SPION材料是由二价和三价铁盐经由化学共沉淀法在基质的存在下合成的。Farini等[23]通过Cell-SELEX技术筛选出能够与热处理后损伤的牛精子结合的适配体，利用抗生物素包被的SPION与适配体和靶细胞结合，形成新的复合物，获得功能正常精子的悬浮液。这种方式可达到剔除损伤精子同时又不损伤正常精子的囊胚卵裂率的目的，显示了与适配体结合应用方式的新思路。

碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs）是一种具有很多独特物理和化学特性的纳米材料，广泛应用于生物医学领域。其中的单壁碳纳米管（sin⁃gle-walled carbon nanotubes，SWNTs）表现出独特的电光学特征，如光热、拉曼效应等。得益于其特殊的sp2杂化碳表面，在理论上能达到1300 m2/g的表面积，从而能够为药物或生物分子等提供大量结合位点，通过细胞的内吞和扩散作用，能自由进出细胞并对细胞无害，成为药物运载的理想材料[24]。将柔红霉素（daunorubicin，Dau）与针对白血病的生物标志蛋白PTK7的DNA适配体sgc8c结合后与单壁碳纳米管连接来增强柔红霉素与Molt-4细胞的靶向递送作用，在细胞内pH5.5的酸性环境下具有较高的药物释放率[25]。Tan等[26]构建了一个单壁碳纳米管辅助的Cell-SELEX筛选系统，在筛选洗脱非结合ssDNA的过程中，利用ssDNA能够通过π电子堆叠作用螺旋缠绕到单壁碳纳米管上，但较适配体与靶细胞亲和力低的特性，筛选中分离未与靶细胞结合的ss⁃DNA，达到比传统洗脱更高的纯度，从而将传统15轮的筛选过程下降到仅需6轮的水平。

介孔二氧化硅颗粒（mesoporoussilica nanoparticles，MSNs）于 1992年被首次合成，因其具有较大的表面积、可调的孔径和便于修改的特性，在药物控释领域广受关注。可以对MSNs表面进行修饰，合成通过pH值和光照双重调控的药物递送系统[27]。Zhang等[28]构建了一个基于介孔二氧化硅包覆的光热剂Cu1.8S颗粒的近红外光反应的DNA混合门控纳米载体。将介孔二氧化硅作为药物载体，而具有丰富GC碱基的DNA适配体作为门控和药物载体及靶向元件。其中MSNs装载疏水性的姜黄素，适配体装载亲水性的阿霉素Dox。通过适配体介导的复合物能够在近红外光辐射合理的释放阿霉素和姜黄素，姜黄素增强MCF-7细胞对阿霉素的协同生长的抑制作用，对MCF-7细胞中的某些凋亡相关基因产生更大影响。说明这一复合物在药物靶向运输中具有巨大潜力。

2.4 适配体与其他分子材料

脂质体是一种由磷脂构成的复合结构，目前已被广泛应用于药物递送。由于脂质体表面疏水内部亲水的特征结构，既可以在其内部装载亲水性药物，也可以在外部脂质双分子膜上装载疏水性药物，是一种运载药物的理想材料。目前已有多种脂质体复合药物进入临床试验，早在1995年，盐酸多柔比星脂质体Doxil已被FDA批准用于艾滋病相关化疗难治型卡波西肉瘤[29]。由于其优良的载药性能，增强其靶向性成为研究的重点方向，将其与适配体连接则能够达成这一目的。Ara等[30]通过聚乙二醇（PEG）修饰的脂质体，连接适配体后形成复合物Apt-PEG-LPs，用荧光分光光度法、激光扫描共聚焦显微镜分别检测小鼠肿瘤内皮细胞的吸收能力，表明复合物从内涵体脱离，网格蛋白介导的内吞作用后参与受体介导的通路。将人肾肿瘤细胞注射小鼠后用共聚焦显微镜观测Apt-PEG-LPs，表明该复合物较单纯的PEG-LP复合物有更高的累积量，且这类复合物除了传递化疗药物外，还能通过脂质体包裹并传递siRNA而不引起免疫系统的特异性激活[31]。

胶束（micelles）是一类诸如脂肪酸、皂和磷脂等表面活性分子的聚集体，具有一个强极性的头和非极性烃链的尾。在水溶液中，这一类分子非极性的尾部聚集成一个类似球形结构的中心，自主装成所谓的胶束[32]。胶束在目前被广泛应用于药物递送系统的研究。雷公藤甲素（triptolide，TP）能够对耐药胰腺癌细胞的增殖起抑制作用，然而对所有组织细胞无特异性的损伤也阻碍了其临床应用。将适配体AS1411连接到PEG的C端并和聚（D，L-丙交酯）连接，组成AS1411-PEGPDLLA胶束，通过固体分散技术装载TP后形成AS-PPT，这一复合物比单纯TP有更好的抗肿瘤效果，且其靶向特异性较AS1411并无下降。实验表明，用AS-PPT治疗患吉西他滨抗人胰腺癌细胞（MIA PaCa-2）的小鼠，较使用单纯抗肿瘤药物盐酸吉西他滨Gemzar的小鼠寿命显著延长，表明胶束适配体复合物能够通过提高靶向性减轻某些药物的毒副作用[33]。

量子点（quantum dots，QD）是把导带电子、价带空穴及激子在3个空间方向上束缚住的纳米晶体半导体材料。由于其优异的光稳定性，被广泛应用于实时追踪成像，也为这种材料成为药物递送系统打下坚实基础。目前已将pH反应性的量子点和异常糖基化黏蛋白-1（MIC1）适配体通过共价键连接，将阿霉素Dox通过pH敏感的腙键与量子点连接，形成的复合物显著促进药物在内涵体内的释放[34]。Singh等[35]将ZnSe/ZnS量子点与光敏剂PS及MUC1适配体装配成复合物，连接到MUC1肿瘤标志物，经光照后复合物产生ROS，杀伤肿瘤细胞，达到靶向治疗的目的。

除上述材料之外，还有一些药物递送系统逐渐被研究开发。如聚合物纳米颗粒PLGA连接适配体同时传递阿霉素Dox、紫杉醇PTX两类不同药物[36]；用ATP适配体构建的树枝状大分子内嵌入阿霉素Dox后，再经表面连接其他肿瘤蛋白特异适配体后靶向进入目的细胞进行药物释放[37]；氧化石墨烯等或将上述某几种材料组合而成的药物递送系统。

3 结语

SELEX技术经过20多年的研究，已经发展了多种类的筛选方式与筛选靶分子，其筛选的最终目标都是特异性高的适配体。而Cell-SELEX技术的应用价值也主要在于获得与靶细胞特异结合的适配体。通过获得的靶细胞特异适配体，我们不仅能够对目的细胞进行诊断检测，而且能够结合各种药物载体对靶细胞进行靶向治疗。目前大部分研究集中在化疗药物对肿瘤细胞的靶向治疗，但特异细胞适配体的应用远远不仅限于此。我们也可以通过某些正常体细胞特异适配体递送药物及生物分子等，从而起到预防及治疗某些非肿瘤性疾病的作用。相信随着研究的深入，SELEX技术及适配体无论在生物医药系统还是在化学材料工程中都会有更为广阔的应用。

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