微生物介导的疟原虫Pfs25和Pvs25疫苗研制现状

李文桂,陈雅棠

重庆医科大学 附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）和间日疟原虫（P.vivax，Pv）是寄生人体的2种常见疟原虫，可分别引起恶性疟和间日疟。大量研究[1-7]表明，用X线照射的疟原虫子孢子或红内期原虫、热灭活的红内期原虫以及去除红细胞的裂殖体免疫小鼠均可有效对抗疟原虫子孢子的攻击。Renia等[8]认为疟原虫疫苗大体经历了全虫疫苗、减毒活疫苗和分子疫苗这几个阶段，但全虫疫苗几乎不能诱导宿主产生有效的保护力，减毒活疫苗存在恢复毒力和临床感染的风险，单个重组蛋白疫苗的免疫效果较差，这就需要进一步研制新型疫苗。

Pfs25和Pvs25存在于疟原虫的配子、合子和动合子的表面，是相对分子质量（Mr）为25 000的受精后抗原，具有4个串联的表皮生长因子样结构域、大量半胱氨酸残基和复杂的四聚体结构，在动合子穿透蚊胃上皮及动合子转为卵囊的过程中起重要作用。吕芳丽等[9]将100 μg的pCDPfs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后10和20 d加强2次，在首次免疫后40 d发现血清IgG升高，脾细胞增殖，CD8+T细胞数目增加；Shimp等[10]将Pfs25与铜绿假单胞菌的外蛋白A（exopro⁃tein A，EPA）融合为Pfs25-EPA，将2.5 μg融合蛋白加铝佐剂皮下注射CD1鼠，在首次免疫后4周加强1次，在首次免疫后6周发现血清IgG升高75倍；Kongkasuriyachai等[11]将 25 μg的 VR1020-Pvs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后5和10周加强2次，在首次免疫后100 d发现血清IgG、IgG1和IgG2a升高，间接免疫荧光（IFA）证实此血清识别Pv合子内的Pvs25蛋白，这些研究表明Pfs25和Pvs25是2种有希望的疫苗分子。

微生物通常对人体具有一定的致病性，随着对微生物致病机制研究的深入，人们发现编码微生物的毒力因子或编码关键代谢途径的酶基因突变以及控制微生物在体内生存的调节基因失活，均可使微生物减毒且保留高度的免疫原性。随后人们构建了根癌农杆菌、酵母菌、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等微生物的减毒株，这些减毒株均可成为有希望的疫苗载体。在此，我们就微生物介导的疟原虫Pfs25和Pvs25疫苗的研制现状做简要综述。

1 细菌介导的疟原虫Pfs25和Pvs25疫苗

1.1 重组根癌农杆菌

1983年Fraley等[12]首次将细菌基因导入植物细胞，而Curtiss等[13]在烟草种子中成功表达了变形链球菌的表面蛋白抗原，这为研制转基因植物疫苗提供了可行性。Jones等[14]将Pfs25基因插入pGRD4得pGRD-Pfs25，电穿孔转化根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacieu，At）的 GV3101株，真空浸染烟草的子叶，培育转基因植株；SDS-PAGE证实转基因植株表达Mr为46 000的Pfs25-FhCMB-6His融合蛋白；将 5 μg融合蛋白加 Al（OH）3佐剂肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后3周加强1次，在首次免疫后6周发现血清IgG滴度为1∶3318～1∶5835，标准膜饲养试验（standard membrane feed⁃ing assay，SMFA）发现首次免疫后6周的鼠血清在体外抑制蚊胃卵囊的发育，抑制率为92%。

Blaborough等[15]将Pvs25基因插入pGRD4得pGRD4-Pvs25，电穿孔转化根癌农杆菌GV3101株，转染烟草子叶，培育转基因植株；SDS-PAGE发现转基因烟草表达Pvs25-FhCMB融合蛋白；将50 μg融合蛋白加Abisco-100佐剂腹腔注射免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3周加强1次，在首次免疫后6周发现血清IgG升高，IFA证实此血清可识别Pv的合子和动合子；合子发育试验（zygote de⁃velopment assay，ZDA）发现此血清抑制蚊胃卵囊的发育，抑制率为65%～74%；在首次免疫后6周腹腔注射106伯氏疟原虫ANKA234株的子孢子进行攻击，在攻击后6～12 d发现鼠血疟原虫的数目减少。

1.2 重组酵母菌

酵母菌及其菌体成分是有效的佐剂，与抗原结合后形成免疫刺激复合物，促进免疫应答。Gozar等[16]将Pfs25基因插入pIXY154得pIXY155，转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2905株，筛选培养阳性菌株；免疫印迹发现Pf患者血清识别重组菌表达Mr为39 000的Pfs25蛋白；将1250 pmol重组蛋白加Al（OH）3佐剂腹腔注射免疫CAF1鼠，在首次免疫后3和6周加强2次，在首次免疫后12周发现脾细胞增殖，血清IgG升高，该血清可抑制血涂片中Pf配子体的发育。Zou等[17]将 25 μg重组蛋白加 Al（OH）3佐剂腹腔注射免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3、6和9周加强3次，在首次免疫后12周发现血清IgG升高，该血清在体外可抑制血涂片中Pf配子体的发育。雷青等[18]将Pfs25基因分别插入pPIC9和pGAPZαA得pPIC10和pGAP-10，分别电穿孔转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115株，筛选阳性菌株，命名为IC-PfS25和GAP-PfS25；然后再将pIC10电转GAP-PfS25株，筛选培养阳性菌株IC-GAP-PfS25；免疫印迹发现Pf患者血清识别血涂片中的Pfs25蛋白，但未进行保护力试验。

2 病毒介导的疟原虫Pfs25和Pvs25疫苗

2.1 重组腺病毒

Schuldt等[19]认为腺病毒血清型 5（Adenovirus serotype 5，Ad5）以及猩猩腺病毒血清型63（Chim⁃panzee adenovirus serotype 63，ChAd63）是2种有希望的疫苗载体，均可有效表达疟原虫的外源抗原；重组腺病毒可诱导记忆性T细胞，诱发长期应答，可诱导CD8+T细胞反应；外源抗原表达在衣壳蛋白纤维或六环上可以提高疫苗效率，降低毒副作用。Goodman等[20]将 1×1010病毒颗粒（viral particles，VP）的 ChAd63-Pfs25肌肉注射 BALB/c鼠，在首次免疫后10周肌肉注射1×107PFU的MVA-Pfs25进行加强，发现血清IgG在首次免疫后2～12周升高，在首次免疫后12周达较高水平，血清IgG1和IgG2a增加；SMFA试验表明首次免疫后12周血清抑制蚊胃卵囊的发育；在首次免疫后12周腹腔注射106伯氏疟原虫ANKA234株子孢子进行攻击，在攻击后3 d用斯氏按蚊（Anopheles stephensis）叮咬24 h，叮咬24 h后解剖蚊胃，发现蚊胃的卵囊数目减少67%～93%。Miyata等[21]将5.1×109PFU的rAd5-Pvs25皮下或肌肉注射BALB/c鼠,在首次免疫后3、5和7周加强3次，在末次反应后2周发现血清IgG升高，SMFA试验证实皮下或肌肉注射组的血清显著降低蚊胃的卵囊数目，减囊率分别为82.4%～87.8%和82.9%～98.6%。

2.2 重组牛痘病毒

Sutter等[22]发现牛痘病毒的减毒株可表达流感病毒的核壳蛋白、麻疹病毒的融合蛋白F以及呼吸道合胞病毒的糖蛋白等。Tine等[23]以Pf基因组DNA为模板扩增Pfs25基因，插入pMLB得pMLB-Pfs25，加牛痘病毒减毒株NYVAC共同转化HeLa细胞，筛选培养重组病毒；免疫印迹发现Pf患者血清识别MYVAC-Pfs25表达Mr为25 000的Pfs25蛋白；将108PFU重组病毒肌肉注射恒河猴，在首次免疫后2和26周加强2次，发现血清IgG在首次免疫后2～35周升高，在首次免疫后6周达较高水平；IFA表明首次免疫后28周血清识别血涂片Pf的Pfs25蛋白。

2.3 重组杆状病毒

昆虫杆状病毒表达系统是一个真核表达系统，可提高外源基因的表达效率，可对表达产物进行糖基化、磷酸化和蛋白切割等。Blagborough等[24]用杆状病毒双表达系统（Baculovirusdual ex⁃pression system，BDES）表达 Pvs25，将 5×107PFU的BDES-Pvs25肌肉注射或滴鼻免疫BALB/c鼠，在首次免疫后3、6和9周加强3次，在首次免疫后11周发现血清 IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b升高，此时腹腔注射106伯氏疟原虫ANKA234株的子孢子进行攻击，在攻击后3 d用50只斯氏按蚊叮咬小鼠，叮咬后24 h解剖蚊胃，计数卵囊数目，发现肌肉注射组和滴鼻免疫的卵囊数目分别下降83.8%和92.1%。

环子孢子蛋白（circumsporozoite protein，CSP）位于成熟子孢子的表面，是Mr为40 000～60 000的细胞前期抗原，在子孢子入侵肝细胞时起关键作用。Epstein等[25]发现pCD-PfCSP肌肉注射健康志愿者可产生有效的免疫应答。由于宿主MHC分子的多样性和疟原虫抗原结构的复杂性，宿主将针对抗原的多个表位产生免疫反应，使得单一抗原成分诱导宿主产生的保护性免疫应答效果往往较低，因此，将PvCSP和Pvs25抗原的编码基因连接起来可能更为有效。Mizutani等[26]用BDES表达Mr为110 000的PvCSP-Pvs25融合蛋白，将1×108PFU的BDES-PvCSP-Pvs25肌肉注射BALB/c鼠，在首次免疫后3和6周加强2次，在首次免疫后8周用3～7只感染伯氏疟原虫的斯氏按蚊叮咬15 min进行攻击，攻击后5～7 d发现免疫组的原虫血症为0.01%～0.77%，而对照组为0.12%～1.69%。

3 结语

尽管大部分现有微生物介导的疟原虫Pfs25和Pvs25疫苗可诱导宿主产生一定的保护性免疫应答，但它们产生的保护力通常较低，远未达到人们所期望的水平；转基因植物疫苗的质量控制和认证较难，普遍不被公众认可和接受[27]；酵母表达系统的蛋白表达水平较高，但其加工修饰与天然蛋白质存在差异；腺病毒的自身蛋白及其双链RNA可作为免疫佐剂，但病毒载体有潜在致癌和致病性，人群普遍存在抗腺病毒的抗体，影响其免疫效果；重组牛痘病毒的安全性和有效性值得进一步的关注；昆虫杆状病毒表达蛋白可以糖基化和磷酸化，但其修饰位点与天然蛋白不同。

随着现代分子生物学和分子免疫学等技术的发展，人们将对疟原虫的基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学及表观遗传学进行深入研究，从而弄清疟原虫的抗原结构与功能的关系，筛选新的抗原分子，构建由各期抗原分子组成的多期多价疫苗；研究这些疫苗的免疫原性、转化效率、MHC限制性以及能否长期在宿主体内表达；研制新型佐剂、疫苗载体和制备融合抗原，提高疫苗的免疫原性；在人体内正确评价新型疫苗分子的保护力及其免疫机制；积极开展疟原虫抗原蛋白家族及其他相关蛋白生物学功能研究，提高疫苗的设计水平；探索疟原虫的体外培养、功能试验、遗传变异、分子病理和理想的动物模型；由于疟原虫已对氯喹产生抗药性以及蚊媒对杀虫剂DDT产生耐受性，还需要研制新型灭疟药和杀虫剂。相信随着这些问题的阐明，必将推动微生物介导的疟原虫Pfs25和Pvs25疫苗研究跃上一个新的台阶。

[1] Clyde D F,Most H,McCarthy V C,et al.Immuniza⁃tion of man against sporozoite-induced falciparum ma⁃laria[J].Am J Med Sci,1973,266(3):169-177.

[2] Richards W H G.Active immunization of chickens against Plasmodium gallinaceum by inactivated homolo⁃gous sporozoites and erythrocytic parasites[J].Nature,1966,212(8):1492-1494.

[3] Vanderberg J P,Nussenzweig R S,Most H,et al.Pro⁃tective immunity produced by the injection of x-irradi⁃ated sporozoites of Plasmodium berghei II effects of ra⁃diation on sporozoites[J].J Parasitol,1968,54(6):1175-1180.

[4] D′AntonioL E.Plasmodium berghei:vaccination of mice against malaria with heat inactivated parasitized blood[J].Exp Parasitol,1972,31(1):82-87.

[5] Zuckerman A,Hamburger J,Spira D.Active immuniza⁃tion of rats with a cell-free extract of erythrocytic par⁃asites of P.berghei[J].Exp Parasitol,1967,21(1):84-97.

[6] Mitchell G H,Butcher G A,Cohen S.Merozoite vacci⁃nation against Plasmodium knowlesi malaria[J].Immu⁃nology,1975,29(2):397-407.

[7] Freeman R F,Holder A A.Characteristics of the pro⁃tective response of BALB/c mice immunized with a prifeec Plasmodium yoelii schizont antigen[J].Clin Exp Immunol,1983,54(3):609-616.

[8] Renia L,Gruner A C,Mauduit M,et al.Vaccination against malaria with live parasites[J].Expert Rev Vac⁃cines,2006,5(4):473-481.

[9] 吕芳丽,余新炳,陈海峰.恶性疟原虫FCC-1/HN株pcDNA3-Pfs25重组质粒在小鼠体内的免疫应答[J].中国人兽共患病学报,1999,15(6):36-39.

[10]Shimp R L Jr,Rowe C,Reiter K,et al.Development of a Pfs25-EPA malaria transmission blocking vaccine asa chemically conjugated nanoparticle[J].Vaccine,2013,31(28):2954-2962.

[11]Kongkasuriyachai D,Bartels-Andrews L,Stowers A,et al.Potent immunogenicity of DNA vaccines encoding Plasmodium vivax transmission-blocking vaccine candi⁃dates Pvs25 and Pvs28-evaluation of homologous and heterologousantigen-deliveryprime-booststrategy[J].Vaccine,2004,22(17):3205-3213.

[12]Fraley R T,Rogers S G,Horsch R B,et al.Expres⁃sion ofbacterialgenesin plantcells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1983,80(15):4803-4807.

[13]Curtiss R I,Cardineau G A.Oral immunization by transgenic plants[P].World Patent Application,1990,90/02484.

[14]Jones R M,Chichester J A,Manceva S,et al.A nov⁃el plant-produced Pfs25 fusion subunit vaccine induc⁃es long-lasting transmission blocking antibody respons⁃es[J].Hum Vac Immunother,2015,11(1):124-132.

[15]Blagborough A M,Musiychuk K,Bi H,et al.Trans⁃mission blocking potency and immunogenicity ofa plant-produced Pvs25-based subunit against Plasmodi⁃um vivax[J].Vaccine,2016,34(17):3252-3259.

[16]Gozar M M,Price V L,Kaslow D C.Saccharomyces cerevisiae-secreted fusion proteinsPfs25 and Pfs28 elicit potent Plasmodium falciparum transmission-block⁃ing antibodies in mice[J].Infect Immun,1998,66(1):59-64.

[17]Zou L L,Miles A P,Wang J,et al.Expression of ma⁃laria transmission-blocking vaccine antigen Pfs25 in Pichia pastoris for use in human clinical trials[J].Vac⁃cine,2003,21(9):1650-1657.

[18]雷青,刘晓,陈勇,等.恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统的构建及表达[J].中国生物制品学杂志,2011,24(11):1249-1253.

[19]Schuldt N J,Amalfitano A.Malaria vaccines:focus on Adenovirus based vectors[J]. Vaccine, 2012,30(26):5191-5198.

[20]Goodman A L,Blagborough A M,Biswas S,et al.A viral vectored prime-boost immunization regime target⁃ing the malaria Pfs25 antigen induces transmission-blocking activity[J].PLoS One,2011,6(12):e29428.

[21]Miyata T,Harakuni T,Sugawa H,et al.Adenovirusvectored Plasmodium vivax ookinete surface protein,Pvs25,as a potential transmission-blocking vaccine[J].Vaccine,2011,29(14):2720-2726.

[22]Sutter G,Staib C.Vaccinia vectors as candidate vac⁃cines:the development of modified Vaccinia virus anka⁃raforantigen delivery[J].CurrDrug TargetsInfect Disorders,2003,3(1):263-271.

[23]Tine J A,Lanar D E,Smith D M,et al.NYVAC-Pf7:a poxvirus-vectored,multiantigen,multistage vaccine candidate for Plasmodium falciparum malaria[J].Infect Immun,1996,64(9):3833-3844.

[24]Blagborough A M,Yoshida S,Sattabongkot J,et al.In⁃tranasal and intramuscular immunization with Baculovi⁃rus dual expression system-based Pvs25 vaccine sub⁃stantially blocks Plasmodium vivax transmission[J].Vac⁃cine,2010,28(37):6014-6020.

[25]Epstein J E,Charoenvit Y,Kester K E,et al.Safety,tolerability,and antibody responses in humans after se⁃quential immunization with a PfCSP DNA vaccine fol⁃lowed by the recombinantprotein vaccine RTS′S/AS02A[J].Vaccine,2004,22(9):1592-1603.

[26]Mizutani M,Iyori M,Blagborough A M,et al.Baculo⁃virus-vectored multistage Plasmodium vivax vaccine in⁃duces both protective and transmission-blocking immu⁃nities against transgenic rodent malaria parasites[J].In⁃fect Immun,2014,82(9):4348-4357.

[27]李文桂,陈雅棠.载体介导的刚地弓形虫MIC疫苗的研制现状[J].中国微生态学杂志,2017,29(6):735-738.