椪柑果醋复合脱苦技术与深层液态发酵工艺*

邹海英，余 佶，余兆硕，张 敏，刘 芳，麻成金

(吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000)

椪柑又名芦柑，汁多爽口，酸甜宜人，富含维生素、胡萝卜素以及多种人体所需的矿物质，其中尤以硒含量见长，是备受消费者喜爱的富硒水果之一.由新鲜椪柑果汁酿制而成的椪柑果醋不仅带有椪柑特有的风味，还具有抑菌、抗氧化、缓解疲劳、预防饮食型肥胖和高脂血症等功效[1-2].由于椪柑中的柚皮苷和柠檬苦素类似物质具有强烈苦味[3],椪柑制品也因味苦问题难以被广泛接受，因此产品脱苦就显得尤为重要.近些年来，国内外对不同果汁的脱苦技术研发主要集中在酶脱苦法、树脂排苦法、代谢脱苦法、包埋脱苦法等.[4-6]柠檬苦素类脱苦酶与柚苷酶等能专一脱除椪柑汁苦味，但存在价格偏高、特定选育困难等问题.活性炭脱苦因其安全性与经济性而被广泛应用，超声波辅助活性炭脱苦的研究也日趋增多[7]，但活性炭吸附苦味的同时会使椪柑饮品中的pH值上升，导致其内部发生化学反应而产生硫化物[8].苦味物质的包埋剂β-环糊精可对活性炭脱苦处理后的椪柑果汁进行再脱苦，并包埋不良气味.[9]本实验以湘西椪柑为研究对象，在超声波辅助活性炭吸附苦味物质的基础上，采用β-环糊精包埋法作进一步脱苦处理，并采用响应面分析法优化脱苦后的椪柑果醋醋酸发酵工艺条件，为生产口味更佳的果醋产品、提高椪柑加工产品的附加值、推动湘西椪柑产业的发展提供帮助.

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

新鲜椪柑：从吉首市农贸市场购置，经测定，糖酸比不小于11.1∶1，糖度11.7%.

试剂：安琪活性干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司)；醋酸菌种(粉包，上海佳民酿造食品有限公司)；柠檬苦素标准品(国药集团)；食用酒精、果浆酶、果胶酶、硅藻土、壳聚糖、活性炭、X16树脂，食品级；无水乙醇、丙酮、二氯甲烷、浓硫酸、高氯酸、冰醋酸、对二甲胺基苯甲醛、FeCl3等，国产分析纯.

主要仪器设备：XB124型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；pHSJ-4F型精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)；FUMA-QYC200型变频摇床(上海福玛实验设备有限公司)；722型分光光度计(上海舜宇恒平有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程和操作要点 本实验工艺流程为：新鲜椪柑—去皮—打浆—酶解—复合脱苦—过滤—调整糖度—酒精发酵—椪柑果酒—酒精度调整—加活化醋酸菌—醋酸液态发酵—灭菌—澄清过滤—椪柑果醋.操作要点：(1)酵母活化.按实验用量称取活性干酵母，在温度38 ℃下保持水浴30 min后，将活化好的酵母液冷却至30 ℃以下备用.(2)醋酸菌活化.将1%葡萄糖和1%酵母膏加入无菌水中加热溶解灭菌，然后冷却至70 ℃，加入4%无水乙醇制成液体活化培养基，然后将菌粉(0.005 g/mL)接入活化培养基中，于32 ℃恒温振荡培养24 h，备用.(3)酶解.将果汁加热至45 ℃恒温，加入0.2%果浆酶和0.15%果胶酶进行酶解.(4)复合脱苦.将酶解后的果汁经超声波辅助吸附剂脱苦，再经β-环糊精包埋复合脱苦，搅拌均匀后，过滤.(5)酒精发酵.酒精发酵工艺参照文献[10]进行，参数作部分调整，椪柑果汁含糖量调整为10%，酵母用量0.05%，发酵温度32 ℃，发酵时间7 d.(6)醋酸发酵.将椪柑果酒醪中酒精度调整为6%，pH值4.2左右，接入活化醋酸菌培养液，恒温摇床震荡至发酵结束.

1.2.2 吸附剂筛选与超声波辅助脱苦实验 首先，控制单一吸附剂(硅藻土、壳聚糖、活性炭)用量为1%，X16树脂用量4%[11]，在温度40 ℃搅拌脱苦60 min后比较脱苦率，并筛选较优的吸附剂；其次，对比单一脱苦剂与超声波辅助后脱苦率，评价超声波应用显著性.超声波条件为超声功率100 W、处理60 min.

1.2.3 醋酸发酵单因素实验 以总酸量为评价指标，选取醋酸菌接种量、发酵时间、发酵温度、摇床转速为考察因素进行单因素实验，初步实验条件选定为醋酸菌培养液接种量8%、发酵温度32 ℃、摇床转速120 r/min，发酵时间5 d.

1.2.4 优化实验 采用Box-Behnken设计(BBD)，以总酸量为评价指标，选择较优因子优化椪柑醋酸发酵的工艺参数.

1.2.6 数据分析 BBD用Design Expert 8.0.6统计软件处理，因素显著性分析用SPSS 20.0统计软件处理，且P<0.05时表明差异显著.

2 结果与讨论

2.1 复合脱苦实验

2.1.1 不同吸附剂对椪柑果汁脱苦效果的影响 结果如图1所示.由图1可知，用X16树脂、硅藻土、壳聚糖、活性炭等4种脱苦剂分别对椪柑果汁进行脱苦，活性炭的效果最好，同时超声波辅助均能显著提高不同吸附剂的脱苦效果.这是因为超声波产生的空穴效应加剧了分子运动，促进了苦味物质分子与吸附剂的有效结合.

2.1.2 不同脱苦技术的效果比较 分别用β-环糊精(组1)、“活性炭+超声波辅助”(组2)、“活性炭+超声波辅助+β-环糊精”(组3)，对椪柑果汁进行脱苦处理，结果如图2所示.

由图2可知，组1效果不明显，组3效果优于组2和组1，而组3和组2脱苦效果差异显著.说明在超声波辅助活性炭脱苦基础上，应用β-环糊精进行脱苦是有必要的.β-环糊精进一步包埋苦味与其他不良风味，脱苦率达到74.37%，因此，本实验选择“活性炭+超声波辅助+β-环糊精组”技术对椪柑果汁进行脱苦处理.

图1 不同吸附剂和超声波辅助脱苦效果Fig. 1 Debittering Effect of Different Adsorbents with and Without Ultrasonic Technology

图2 不同脱苦技术的效果Fig. 2 Debittering Effect of Different Techniques

2.2 酒精发酵

[10]，在果汁含糖量10%、酵母添加量0.05%、发酵温度32 ℃、发酵时间7 d的条件下进行酒精发酵，得椪柑果酒醪，酒精度实测值5.5%(V/V).

2.3 醋酸发酵单因素实验

2.3.1 醋酸菌接种量对醋酸发酵的影响 结果如图3所示.由图3可知：醋酸菌培养液接种量在4%～14%时，随着发酵时间增加，总酸逐渐增加；第4天后，4%接种量的实验组醋酸发酵仍保持较快增长速度，14%接种量实验组醋酸菌代谢争夺，总酸量反而略有下降，其余实验组发酵速度减缓；各组在第5天后总酸量增长不明显.因此，醋酸菌培养液接种量选择6%～12%，发酵时间选择5 d左右为宜.

图3 醋酸接种量对醋酸发酵的影响Fig.3 Effect of Inoculum Size of Acetic Acid Bacteria on Fermentation

图4 发酵温度对醋酸发酵的影响Fig. 4 Effect of Temperature on Acetic Acid Fermentation

图5 摇床转速对醋酸发酵的影响Fig. 5 Effect of Rotation Speed of Shaker on Acetic Acid Fermentation

2.3.2 发酵温度对醋酸发酵的影响 结果如图4所示.由图4可知：发酵温度为28～32 ℃时，随着温度上升，总酸量快速升高；发酵温度超过32 ℃后，发酵增速开始减缓；至34 ℃总酸量开始下降，高温严重抑制了醋酸菌中氧化酶的活性.因此，醋酸发酵的温度控制在32 ℃左右为宜.

2.3.3 摇床转速对醋酸发酵的影响 结果如图5所示.由图5可知：摇床转速在80～120 r/min时，随着转速上升，总酸量快速升高；至120 r/min后增速减缓；至160 r/min时，总酸量达最大值；此后总酸量开始下降.因此，结合工业生产实际，醋酸发酵的摇床转速控制在120～160 r/min为宜.

2.4 BBD优化醋酸发酵实验

2.4.1 BBD实验设计 BBD优化椪柑果醋醋酸发酵的实验因素水平编码见表1，BBD方案及结果见表2.

表1 BBD实验因素水平编码

表2 BBD方案及结果

利用Design Expert 8.0.6软件对表2实验数据进行多元回归拟合分析.二次多元回归模型方程为

Y= 5.20+0.15A+0.087B+0.13C+0.050D+0.022AB-0.095AC-0.033AD+

0.053BC-0.018BD+0.030CD+0.068A2-0.11B2-0.096C2-0.12D2.

2.4.2 优化工艺模型方差分析及其显著性检验 对该模型进行方差分析，结果见表3.

表3 模型的方差分析结果

续表3

②显著(0.01

由表3可知，该模型极显著(P<0.05)且失拟项不显著(P>0.05)，说明Design Expert 8.0.6软件对优化模型与实验数据能进行较好的拟合，可用于椪柑果醋醋酸发酵工艺优化的预测及分析.实验因素对醋酸发酵的影响大小顺序为A，C，B，D.舍弃不显著的实验因子，拟合公式可简化为

Y=5.20+0.15A+0.087B+0.13C+0.050D-0.095AC-0.033AD+0.053BC+

0.030CD+0.068A2-0.11B2-0.096C2-0.12D2.

图6 醋酸菌接种量与发酵温度的响应面分析Fig. 6 Response Surface Analysis of Inoculum Size and Fermen- tation Concentration of Acetic Acid Bacteria

2.4.3 响应曲面分析 对椪柑果醋醋酸发酵过程影响较显著的4个交互因子进行三维响应面分析，结果如图6—8所示.结合方差分析和响应曲面的陡度走势及等高线密度，进一步表明了实验因子对响应值的影响关系，A-C和B-C均存在极显著的交互作用，同时A-D和C-D交互作用显著，说明椪柑果醋的醋酸发酵受4个因素作用明显，验证了考察因子选择的正确性.

由图6可知：发酵时间与发酵温度一定时，总酸量随醋酸菌接种量的增加而增加；在底物充足的条件下，醋酸菌生长旺盛，持续产酸，发酵过程中应该对醋酸菌接种量严格控制.由图7可知，在发酵温度一定时，总酸量随发酵时间的增加而先增加后减小，反之亦然.图8中两因素的交互作用与图7类似，此种情况下，选用响应面预测优势明显.

图7 发酵时间与发酵温度的响应面分析Fig. 7 Response Surface Analysis of Fermentation Time and Temperature

图8 发酵温度与摇床转速的响应面分析Fig. 8 Response Surface Analysis of Fermentation Temperature and Rotation Speed

2.4.4 醋酸发酵优化条件与验证 Expert-Design 8.0.6软件分析结果表明，以椪柑酒醪为原料的醋酸发酵工艺优化条件为：醋酸菌培养液接种量10.0% (mL)，摇床转速122.13 r/min，发酵温度32.73 ℃，发酵时间5.6 d.在此条件下，醋酸发酵的每100 mL果醋理论产酸量为5.64 g.充分考虑实际操作情况，将工艺参数修正为:醋酸菌培养液接种量10%(mL)，摇床转速120 r/min，发酵温度33 ℃，发酵时间6 d.3组平行验证实验每100 mL果醋总酸实测值为5.52±0.032 g，与理论值差异不显著，故采用BBD优化的醋酸发酵条件，具有实用价值.

2.5 脱苦效果的感官评价

对果汁、果醋分别进行苦味的感官评价.感官评价按6个苦味等级进行打分：0分，完全不苦；1分，刚好可以感受到苦味；2分，微苦；3分，苦味较明显；4分，苦味强烈；5分，苦味无法忍受.结果见表4.

表4 苦味感官评价

注：不同字母代表组间苦味有显著差异.

由表4可知：未脱苦果醋与未脱苦果汁的苦味差异不显著，但未脱苦果醋的苦味比未脱苦果汁高；同时脱苦果醋与脱苦果汁苦味差异不显著，但脱苦果醋的苦味也比脱苦果汁要高.这可能是柚皮苷、柠檬苦素等苦味物质在醋酸发酵过程中进一步缩合，使得苦味加重的原因.2种产品脱苦前后相比苦味均有显著差异，脱苦后果醋的苦味更接近脱苦的果汁，这充分说明前期脱苦有效避免了发酵过程中苦味的进一步生成，实验所采用的复合脱苦技术是有效的，对椪柑果醋的苦味脱除有较大应用价值.

3 结论

(1)本工艺以新鲜椪柑为原料，榨汁后经复合脱苦、酒精发酵、醋酸发酵等工序制得脱苦型椪柑果醋.用BBD优化得到的果醋发酵参数为：醋酸菌培养液接种量10%(mL)，摇床转速120 r/min，发酵温度33 ℃，发酵时间6 d.此条件下，所得果醋成品色泽鲜亮，苦涩感少，酸味协调，每100 mL果醋总酸实测值为5.52 g，差异不显著，说明整体工艺参数合理.

(2)脱苦实验结果表明，应用复合脱苦技术后，果醋脱苦率可达74.37%，复合脱苦技术对椪柑果醋中的苦味剔除感官评价效果较为理想，具有较大应用价值，但也存在复合脱苦处理时间较长、增加超声波设备等问题，需进一步合理优化.

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