嗜甲基细菌Serratia Marcescens NH8的筛选及其pqq基因的克隆*

彭乔木，周璐璐，熊 力，彭清忠，胡 广

(1.长沙医学院，湖南 长沙 410219；2.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone,PQQ)是20世纪70年代末发现的一种氧化还原酶的新辅酶，是继黄素核苷酸(FMN，FAD)和烟酰胺核苷酸(NAD，NADP)之后发现的第3种辅酶.[1]PQQ类似水溶性B族维生素，广泛存在于水果、蔬菜、谷物和饮品等食物中，其质量浓度范围在3.65～61.0 μg/L[2].缺乏PQQ的实验小鼠出现繁殖能力低下的现象[3]，推测它对人类也有类似的影响.人乳中PQQ及其衍生物TPQ(Topaquinone)总质量浓度达140～180 μg/L，比一般食物(如蔬菜和肉类)的PQQ含量高几十倍[4]，暗示该物质对婴幼儿的生长发育起至关重要的作用.PQQ还具有抗肿瘤、清除自由基、解毒消炎、神经细胞的修复和抗II型糖尿病等功能.[5-6]

目前，PQQ主要来源是化学合成，步骤繁琐、产率低、提纯困难，应用于药物或食品添加剂成本高，不适于推广.相比之下，微生物发酵法生产PQQ具有步骤少、周期短、成本低等优势，是未来PQQ工业化生产的发展方向.研究表明，PQQ由某些革兰氏阴性菌以谷氨酸和酪氨酸为底物合成，作为葡萄糖脱氢酶、乙醇脱氢酶和甲醇脱氢酶的辅酶而存在[7].在能合成PQQ的革兰氏阴性菌中，一些细菌产生极少量PQQ，供其自身代谢所需，如恶臭假单胞菌(Pseudomonasputidasp)[8]；另外一些细菌，如甲基利用型细菌(Methanol-utilizing bacteria)，野生菌株产PQQ量约为2～3 mg/L，通过优化培养条件可达每升几毫克至几十毫克[9-11].但总的来说，微生物菌株产PQQ的量仍然较低.为了实现微生物发酵法生产PQQ，有必要开展以下工作：首先，筛选产PQQ量较高的微生物菌株，并开展遗传育种；其次，通过基因工程手段构建生物合成PQQ的工程菌，通过发酵提高PQQ产量.基于此，笔者利用甲醇为唯一碳源的选择培养基富集筛选嗜甲基营养菌，然后通过多轮PCR扩增，克隆pqq基因簇的全长基因，并进行其结构和生物信息学分析，为下一步构建高产PQQ的工程菌以及研究其生物合成机制提供理论和实验基础.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

土壤样品：采集湖南省永顺县小溪国家自然保护区森林腐殖质土壤.

试剂：LATaq酶、pMD18-T载体、PCR产物回收试剂盒，以及其他分子生物学试剂均购自大连宝生物有限公司；引物合成及目的基因测序由上海生工生物工程有限公司完成；其他化学试剂均为分析纯.

1.2 培养基

富集培养基：KH2PO42.5 g/L，MgSO40.2 g/L，NH4NO33.0 g/L，Fe2SO40.1 g/L，K2HPO42.0 g/L，CH3OH 10 mL，蒸馏水1 000 mL.筛选培养基：MgSO41.5 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，KH2PO41.4 g/L，Na2HPO43.0 g/L，柠檬酸铁30 mg/L，CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl2·4H2O 0.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 5 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，CH3OH 10 mL，1.5%琼脂，蒸馏水1 000 mL.LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂15 g/L，蒸馏水1 000 mL，调节pH值至7.0.

1.3 嗜甲基营养菌的筛选与分离

称取土壤样品10 g，加入90 mL无菌水，120 r/min振荡1 h使土样充分混匀.取1 mL土壤悬液加入富集培养基中，28 ℃ 180 r/min振荡培养2～3 d.取7根试管，依次标记A—G，并向每管中注入9 mL双蒸水，然后取1 mL富集培养液加入A管的无菌水中，制成10-1的稀释液；从A管稀释液中吸取1 mL液体加入B管的9 mL无菌水中，制成10-2稀释液；……依此类推，制成10-4～10-7的稀释液.分别吸取1 mL的D—G中的10-4～10-7梯度稀释悬液，用玻璃涂布棒均匀涂布在筛选培养基平板上.每个梯度稀释液涂布3块平板，分别编号，放入28 ℃培养箱中培养5～7 d.每隔1 d观察平板中微生物生长情况，当平板上出现均匀分布且长势良好的单菌落时，挑取单菌落在LB固体培养基上进行四分区划线.为达到纯化目的，每株菌传代3次，选取其中长势良好的菌株保存备用.

1.4 细菌16S rRNA基因的扩增和菌株鉴定

采用CTAB/NaCl法提取细菌基因组DNA做为模板，用细菌16S rRNA基因的通用引物F27和R1492为扩增引物.配置50 μL的PCR反应体系：10×PCR buffer (5 μL)，dNTP Mixture (0.4 μL)，正向引物 (0.4 μL)，反向引物 (0.4 μL)，基因组DNA (2.0 μL)，LATaq酶 (0.1 μL)，ddH2O (41.7 μL).PCR反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共30个循环，72 ℃ 10 min.琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，配置的琼脂糖凝胶质量分数为1.2%.检测合格的PCR产物送大连宝生物有限公司测序.

根据测序结果，采用BLAST搜索程序从GenBank数据库中下载相似性较高的相关菌株的16S rRNA基因序列，用CLUSTAL-X软件进行16S rRNA基因序列多重比对，然后根据Kimura模型估算系统进化距离矩阵，再使用MEGA 5.2软件，以邻接法(Neighbor-Joining)进行聚类分析和系统发育树构建.结合菌株形态特征，将其初步鉴定到属水平.

1.5 pqq基因簇引物设计及全长pqq基因的克隆

在GenBank数据库中下载8株细菌的pqq基因簇序列pqqB，pqqC，pqqD和pqqE，使用CLUSTAL-X软件进行序列多重比对.根据比对分析结果，选取碱基序列高度保守的片段作为引物设计靶标，首先设计2对引物pqqB-F和pqqC-R，pqqC-F和pqqE-R(表1)，利用这2对引物进行PCR扩增.配置PCR反应体系 (50 μL)：10×PCR buffer (5 μL)，dNTP Mixture (0.4 μL)，正向引物 (0.4 μL)，反向引物 (0.4 μL)，基因组DNA (2.0 μL)，LATaq(0.1 μL)，ddH2O (41.7 μL).PCR反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，共30 个循环，72 ℃ 10 min.经上述PCR扩增，获得筛选菌株的部分pqq基因簇片段序列.扩增产物送大连宝生物有限公司测序.

将测序结果送GenBank数据库中进行BLAST比对分析.选取与扩增片段的pqq基因簇核苷酸序列同源性最高的序列为模板，设计引物pqqA-F和pqqF-R(表1)，利用这对引物，配置相应的PCR反应体系，扩增筛选菌株的pqq基因簇全长序列，并对该全长序列进行测序分析.

2 结果与讨论

2.1 嗜甲基营养菌的筛选及其系统发育分析

通过富集、筛选，纯化获得了26株嗜甲基营养菌，笔者选取其中长势最好的一株嗜甲基营养细菌(编号NH8)开展后续研究工作.形态观察NH8菌株菌落凸起、中心不透明、边缘不规则，可产生红色色素.以菌株NH8的基因组DNA为模板，F27和R1492为引物，PCR扩增获得约1.5 kb的16S rRNA基因片段.对扩增产物进行测序和序列比对分析，构建了基于16S rRNA基因序列的菌株NH8及其系统发育关系密切的典型菌株的系统进化树，如图1所示.

图1 基于16S rRNA基因序列的系统发育树Fig. 1 Phylogenetic Tree Based on 16S rRNA Gene Sequence

由图1可知，菌株NH8与Serratiamarcescensstrain B3R3聚在一支，两者16S rRNA基因序列同源性为99.5%.结合形态特征，初步鉴定菌株NH8属于粘质沙雷氏菌属(Serratiamarcescens)，将其命名为SerratiamarcescensNH8.

2.2 pqq基因簇引物的设计及全长pqq基因的扩增

从GenBank数据库下载8株细菌pqq基因簇的pqqB，pqqC和pqqE片段序列，8株菌株分别为BurkholderiacepaciaATCC 25416 (NCBI登录号CP012982.1)，AcinetobacteroleivoransDR1 (NCBI登录号CP002080.1)，BurkholderiagladioliATCC 10248 (NCBI登录号CP009322.1)，KlebsiellapneumoniaFDAARGOS_447 (NCBI登录号CP023949.1)，MethylobacteriumextorquensAM1 (NCBI登录号CP001510.1)，Serratiamarcescenssubsp.marcescensDb11(NCBI登录号HG326223.1)，AcinetobacterpittiiPHEA (NC_016603.1)，PseudomonasaeruginosaPA83 (NCBI登录号CP017293.1).通过CLUSTAL X软件进行序列多重比对，根据比对结果设计了2对引物pqqB-F和pqqC-R，pqqC-F和pqqE-R(序列多重比对和引物设计见图2).

A—pqqB;B—pqqC;C—pqqC;D—pqqE.图2 pqq基因簇核苷酸序列多重比对Fig. 2 Multiple Alignments of Nucleotide Sequences Against pqq Genes Cluster

1—pqqB-F & pqqC-R；2—pqqC-F & pqqE-R；3—pqqA-F & pqqF-R；M—DNA Marker.图3 3对引物的PCR扩增产物Fig. 3 PCR Products Based on Three Pairs of Primers

以SerratiamarcescensNH8基因组DNA为模板，利用引物pqqB-F和pqqC-R，pqqC-F和pqqE-R分别扩增得到约1 500 bp和1 200 bp的2条条带(图3泳道1，2)，将目的条带切胶回收，纯化后双向测序，获得pqqB，pqqE基因部分核苷酸序列信息和pqqC，pqqD基因全部序列信息.接着，将所测序的核苷酸序列拼接，送GenBank数据库用BLAST分析.结果表明，扩增获得的SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇片段序列与Serratiamarcescensstrain B3R3(登录号CP013046)的pqq基因簇同源性达到99%.因此，笔者参照Serratiamarcescensstrain B3R3的pqq基因簇全序列设计了引物pqqA-F和pqqF-R(表1)，利用这对引物成功扩增出SerratiamarcescensNH8的pqq全长基因片段，其长度约为5.5 kb(图3泳道3).目的条带经纯化后进行T克隆和测序，得到SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇全部核苷酸序列.BLAST比对分析表明，SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇全长序列与SerratiamarcescensWW4(登录号CP003959)的pqq基因簇序列同源性高达99%，与Serratiamarcescensstrain B3R3(登录号CP013046)，Serratiamarcescensstrain U36365(登录号CP016032)和Serratiasp. FS14(登录号CP005927)的pqq基因簇核苷酸序列同源性高达98%.

2.3 pqq基因簇结构和生物信息学分析

SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇结构排布如图4所示，包含6个开放阅读框，分别为pqqA，pqqB，pqqC，pqqD，pqqE和pqqF.其中：基因pqqA与pqqB间隔58 bp，基因pqqB与pqqC间隔9 bp，基因pqqE与pqqF间隔2 bp；基因pqqC，pqqD和pqqE有部分核苷酸序列重叠现象，pqqC与pqqD重叠1 bp，pqqD与pqqE重叠8 bp.

SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇序列全长5 535 bp，相对分子质量约2.0×105，由1 819个氨基酸组成.其中：pqqA基因大小78 bp，编码25个氨基酸，相对分子质量2.8×103，PqqA短肽中保守的谷氨酸和酪氨酸是作为PQQ生物合成的骨架而起作用[12]；pqqB基因大小912 bp，编码303个氨基酸，相对分子质量3.3×104，PqqB可能涉及PQQ穿越质膜进入细胞周质的活动[13]；pqqC基因大小756 bp，编码251个氨基酸，相对分子质量2.8×104，PqqC是Pqq中最具有特征性的蛋白，通过催化8个电子参与的氧化反应，使PQQ前体发生环化，从而生成PQQ[14]；pqqD基因大小279 bp，编码92个氨基酸，相对分子质量1.0×104；pqqE基因大小1 137 bp，编码378个氨基酸，相对分子质量4.2×104；pqqF基因大小2 313 bp，编码770个氨基酸，相对分子质量8.5×104.单个基因敲除实验表明，pqq基因簇中4个基因的产物PqqA，PqqC，PqqD和PqqE是PQQ合成所必需的蛋白[7].核酸序列分析结果表明pqqB，pqqC，pqqD，pqqE和pqqF基因构成细菌操纵子发挥作用.

图4 Serratia Marcescens NH8的pqq基因簇结构Fig. 4 Structure of pqq Genes Cluster from Serratia Marcescens NH8

3 结语

据文献报道，PQQ 生物合成中涉及4～7个相关基因(pqq基因簇).如贪铜菌(Cupriavidustaiwanensissp.)的pqq基因簇包括pqqA，pqqB，pqqC，pqqD和pqqE[15]；菠萝泛菌(Pantoeaananatissp.)和水生拉恩菌(Rahnellaaquatilissp.)的pqq基因簇包括pqqA，pqqB，pqqC，pqqD，pqqE和pqqF[16-17]；外链甲基杆菌(Methylobacteriumextorquenssp.)的pqq基因簇包括pqqA，pqqB，pqqC，pqqD，pqqE，pqqF和pqqG[14]等.笔者筛选的SerratiamarcescensNH8菌株也由pqqA，pqqB，pqqC，pqqD，pqqE和pqqF6个基因组成pqq基因簇.相似的结果表明，微生物合成PQQ的相关基因具有进化保守性.同时，多重比对发现微生物种属之间参与PQQ生物合成的基因在数量和结构上存在一些差异，表明生物合成PQQ的pqq基因簇具有遗传多样性.正因为如此，笔者采用分段克隆法，逐步获得SerratiamarcescensNH8中pqq基因簇全长基因.

笔者通过富集培养分离了26株嗜甲基营养菌，HPLC检测各菌发酵液发现仅产微量的PQQ或无法检测到PQQ(数据未发表)，表明这些菌株合成PQQ的产量极低.选取长势优良的菌株NH8，开展了基于16S rRNA基因序列的系统发育分析，初步鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens).通过PCR引物设计，成功克隆出合成PQQ的pqq基因簇全长序列，并分析了其结构和功能.工作的开展既为生物合成PQQ积累了微生物种质资源，也为后续高效合成PQQ的重组工程菌构建和PQQ代谢调控网络的阐明提供了基因资源.

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