COL6A3基因多态性与中国散发孤立性肌张力障碍的关联

马凌燕，马惠姿，冯涛

首都医科大学附属北京天坛医院神经变性病科，北京市100050

肌张力障碍(dystonia)是一种以持续或间歇性肌肉收缩所致的动作和/或姿势异常为特征的运动障碍，常反复发作，有典型发作模式和肢体扭曲，并可伴有震颤[1-2]。孤立性肌张力障碍(isolated dystonia)临床上仅表现为肌张力障碍，包括扭转痉挛、眼睑痉挛、口下颌肌张力障碍、痉挛性斜颈、痉挛性构音障碍、书写痉挛等。孤立性肌张力障碍是一类病理生理复杂、机制未明的运动障碍性疾病，研究表明多数患者存在基因异常的生理基础。目前研究发现，20余种基因与肌张力障碍相关[3-6]，但大多数散发孤立性肌张力障碍患者致病基因检出率低，可能与多种因素有关。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为人类可遗传变异中最常见的一种，常用来评估人群遗传易感性。已发现十余个SNP与孤立性肌张力障碍相关，其中 rs1801968(D216H)[7]、rs1182[8]、rs3842225[9]与局灶型或节段型肌张力障碍相关，rs6265(BNDF Val66met)与伴有上肢震颤的痉挛性斜颈相关[9-10]。

Zech等[11]采用全外显子测序对德国一个常染色体隐性遗传早发型肌张力障碍家系进行分析，发现COL6A3可能是其致病基因。该基因位于2q37，包含43个外显子，编码Ⅵ型胶原蛋白α3亚单位。另有研究对955例肌张力障碍患者进行COL6A3基因41和42外显子筛查，未检测到明确致病突变，提示突变概率极低[12]。

散发肌张力障碍占肌张力障碍的多数，从遗传易感性SNP入手研究COL6A3基因与肌张力障碍相关性成为可能。本研究从遗传易感性方面探讨COL6A3基因多态性与中国人群散发孤立性肌张力障碍的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2014年9月至2017年8月就诊于首都医科大学附属北京天坛医院神经内科运动障碍病门诊的散发孤立性肌张力障碍患者127例，否认家族类似病史。根据受累部位，局灶型肌张力障碍87例(痉挛性斜颈45例，颅段肌张力障碍39例，书写痉挛2例，痉挛性构音障碍1例)，节段型肌张力障碍31例，全身型肌张力障碍9例。全部患者均符合肌张力障碍的诊断标准[1]，并通过病史、体格检查和辅助检查排除继发性肌张力障碍，包括围产期损伤、中毒外伤史、服用抗精神病药物、查体存在病理征、影像学检查提示基底节区存在可以解释相关症状的异常信号、血液检查(铜蓝蛋白、血清铜、24 h尿铜、有机酸等)异常及其他可导致肌张力障碍的疾病。所有患者均排除DYT1/TOR1A及DYT6/THAP1异常。

同期130例既往健康，无神经系统疾病，性别、年龄与患者匹配的健康体检者作为对照组。两组一般资料见表1。

所有受试者均签署知情同意书。本研究方案经首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会审核通过。

表1 受试者一般资料比较

1.2 SNP筛选

参考Hapmap计划筛选标准，在千人基因组数据库(http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index)中进行COL6A3基因41外显子SNP筛选，以总体人群、欧洲人群、非洲人群、美洲人群、亚洲南部人群及亚洲东部人群最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)＞0.05为标准选取目标SNP。

1.3 限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)

受试者采集静脉血2～3 ml，应用QIAGEN全基因组DNA提取试剂盒从全血中提取基因组DNA。PCR-RFLP检测COL6A3基因多态性。采用Primer 5.0软件设计引物。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。χ2拟合优度检验计算Hardy-Weinberg平衡。计量资料采用方差分析，基因型和等位基因频率比较采用χ2检验。对于不同基因型(3组)间发病年龄比较，数据符合正态分布，采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 目标SNP

共得到符合条件SNP位点2个，分别为rs1131296和rs2270669，它们在亚洲东部人群的MAF分别为0.4802、0.7312。

rs1131296引物序列：上游5'-TCC CAT TTC CAT TCT GTG TTT-3'，下游5'-TTC ACA TTT CAT GTA TGC TGATAGA-3'。

rs2270669引物序列：上游5'-TCC CAT TTC CAT TCT GTG TTT-3'，下游5'-TTC ACA TTT CAT GTA TGC TGATAGA-3'。

2.2 基因型及等位基因频率分布

两组Val66Met位点基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡。见表2。rs1131296在病例组和对照组中GG、GA、AA基因型分布，以及等位基因频率无显著性差异(P＞0.05)。rs2270669在病例组和对照组中CC、CG、GG基因型分布，以及等位基因频率无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表2 两组基因型及等位基因频数比较(n)

2.3 不同基因型间起病年龄

病例组中，rs1131296 GG型起病年龄(42.86±14.79)岁，GA型(38.36±12.34)岁，AA型(40.58±15.78)岁(F=0.100,P=0.905)。rs2270669 CC型起病年龄(39.58±15.12)岁，CG型(40.36±13.59)岁，GG型(42.58±10.73)岁(F=0.074,P=0.929)。2个SNP中3个基因型患者起病年龄无显著性差异(P＞0.05)。

3 讨论

本研究显示，肌张力障碍患者基因型和等位基因分布与对照组无显著性差异，各基因型间起病年龄也无显著性差异，提示COL6A3基因41外显子多态性与我国散发孤立性肌张力障碍无关。

Zech等[11,13]发现COL6A3基因复合杂合突变可能与常染色体隐性遗传肌张力障碍有关。在3个存在COL6A3基因突变的德国家系共5例患者中，所有患者均为早发型肌张力障碍，起病年龄＜25岁；其中3例以斜颈起病，2例以手部肌张力障碍起病，症状可在数年内逐渐进展至身体其他部分，表现为局灶型或节段型肌张力障碍。这3个家系中共存在5个突变，分 别 为 c.9128G＞A(p.Arg3043His)+c.9245C＞G(p.Pro3082Arg)、c.8966-1G＞C(p.Val2989_Lys3077delins-Glu)+c.7502G＞A(p.Arg2501His)、 c.8966-1G＞C(p.Val2989_Lys3077delinsGlu) + c.7660G＞A (p.Ala2554Thr)，所有患者均在41号外显子存在基因突变。此后其对367名孤立性肌张力障碍患者和376名正常对照进行COL6A3基因筛查，发现2例COL6A3基因突变所致肌张力障碍患者和另外43个突变位点(杂合子)，患者杂合子检出率为9.5%(35/367)，对照组检出率为6.1%(23/376)[11,14]。

COL6A3基因位于2q37，包含43个外显子，编码Ⅵ型胶原蛋白α3亚单位[15-16]。该蛋白为异源三聚体，是一种细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)蛋白，能够产生微纤维网络结构，在全身各处均有表达，成年大鼠脑中以脑干和中脑表达量最高[11]。ECM在中枢神经系统参与神经发育和退行病变[17-18]。在中枢神经系统中，胶原蛋白不仅发挥结构连接功能，而且广泛参与细胞生理过程，包括神经环路形成和维持[19-20]。

Ⅵ型胶原蛋白由3个α链组成，α1(Ⅵ)、α2(Ⅵ)、和α3(Ⅵ)，分别由 COL6A1、COL6A2和COL6A3基因编码，每个都有N-末端和C-末端非胶原结构域，由三螺旋结构连接。以前的研究发现，COL6A3基因突变与神经系统疾病有关，特别是骨骼肌疾病，如Ullrich先天肌萎缩和Bethlem肌病[7-8,15,21]。但COL6A3基因突变的肌张力障碍患者MRI未见肌肉萎缩征象。另外发现，所有COL6A3型肌张力障碍患者至少存在1个影响41号外显子的突变位点(位于41号外显子内或其内含子中)，推测肌张力障碍发病可能与该外显子编码蛋白结构域受损有关。

突触可塑性受损是肌张力障碍发病机制之一[22-25]。COL6A3基因41号外显子编码Ⅵ型胶原蛋白α3的部分C4结构域(FN-Ⅲ模体)，可能参与突触结构可塑性而发病[26]。推测与肌张力障碍发病相关的COL6A3基因突变发生在α3(Ⅵ)链的C-末端，至少有1个突变位点位于41号外显子，而肌病相关的致病突变多位于N-末端和三螺旋结构内[27-30]，基因突变部位不同而导致不同疾病，并可将肌张力障碍与其他肌肉疾病加以区分。COL6A3基因突变所致肌张力障碍在同一家系中表现非常相似，但不同家系差异较大。

目前仅有一项肌张力障碍COL6A3基因筛查研究[12]，纳入955例孤立性或混合性肌张力障碍患者(898例高加索人种，57例亚洲人，不含中国)，首先对COL6A3基因的41和42号外显子进行筛查，对筛查出的9例突变携带者检测其余41个外显子，未发现致病突变，提示COL6A3基因非肌张力障碍常见致病原因。

SNP作为人类可遗传变异中最常见的一种，常用来评估人群中遗传易感性。已发现十余个SNP与孤立性肌张力障碍相关，但不同基因、不同人群结果差异较大。目前尚无关于COL6A3基因多态性与肌张力障碍相关性研究。鉴于既往研究提示COL6A3基因41号外显子可能在肌张力障碍的发生发展中发挥重要作用，我们对41号外显子进行SNP筛查，发现2个多态性位点：rs1131296和rs2270669。研究显示，这两个位点SNP均与中国散发孤立性肌张力障碍无关。

本研究存在一定局限性。本研究是基于医院的病例-对照研究，选择偏倚难以避免；多态性位点位于COL6A3基因41号外显子上，可能不能完全代表整个基因易感性情况。尚需大规模研究支持。

本研究显示，COL6A3基因41外显子多态性并非中国孤立性肌张力障碍人群的遗传易感因素。今后可扩展至COL6A3基因多个多态性位点，在不同人群、大样本病例研究中证实。

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