早期区域动脉灌注微量低分子肝素改善高脂血症性急性胰腺炎微循环的实验研究

吕贺贺，项和平，王 伟，李 贺，高 明

近年来，随着人民生活水平的不断提高，人们的饮食结构及生活方式也发生了很大的变化，高脂血症、肥胖、糖尿病的发病率呈逐年上升趋势，其中由高脂血症导致的高脂血症性急性胰腺炎(hyperlipidemic acute pancreatitis， HLAP)的发病率也越来越高。临床研究[1]表明高脂血症性急性胰腺炎的发病率约占据了全部急性胰腺炎总数的1.3%～3.8%。HLAP并发症多、进展迅速、易反复发作、重症化率及死亡率高,其诊治具有自身特点[2-3]。但其发病机制仍不是十分明确，目前临床治疗效果差强人意，因此积极寻求快速有效的治疗HLAP的治疗方案已迫在眉睫。本课题组在前期的研究中发现高脂血症性胰腺炎中胰腺微循环功能障碍与病情恶化具有相关性，推断胰腺微循环障碍可能是高脂血症性胰腺炎病情加重的重要环节之一。该文拟探讨区域动脉灌注微量低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)对HLAP微循环变化的影响，从而更好地为临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组 健康成年雄性仓鼠共60只，清洁级，30～45 g，饲养在标准实验室条件下，在整个实验过程中保持饲养环境的昼夜节律。所有仓鼠自由进水，室内光照遵循12 h明暗周期(7：30 am开灯)，温度恒定于23～25 ℃，湿度为(55±5)%。均使用相同的高脂饲料(20%猪油+10%胆固醇+1%甲基硫氧嘧啶+1%胆酸钠+68.9%普通饲料)在同等条件下喂养，饲养4周后取所有动物静脉血检测三酰甘油水平，并予以实验动物行肝胆胰B超检查，随机抽出30只三酰甘油水平升高3倍以上且肝胆胰无病变者作为最终实验对象。30只仓鼠随机均分为3组：区域动脉输注生理盐水组(LAI+saline组)、区域动脉输注低分子肝素组(LAI+LMWH组)、静脉输注低分子肝素组(IV+LMWH组)。剩余仓鼠作为供体，为试验仓鼠供血。所有仓鼠每周进行称重，并由专人观察体质量变化情况。

1.1.2各组造模及给药 ① LAI+saline组：造模成功后关腹，30 min后经腹主动脉灌注生理盐水；② LAI+LMWH组：造模成功后关腹，30 min后经腹主动脉灌注等量LMWH；③ IV+LMWH组：造模成功后关腹，30 min后经静脉灌注等量LMWH。

1.1.3试剂与药物 3.5%的牛磺胆酸钠溶液试剂及生理盐水(美国Sigma公司)；已配置的1%戊巴比妥钠及丫啶橙靶向白细胞染料(上海化学试剂公司)；高三酰甘油特质高脂饲料(20%猪油+10%胆固醇+1%丙基硫氧嘧啶+1%胆酸钠+68.9%普通饲料)；Pentax ISC-1000型激光共聚焦显微镜(中国科学技术大学生命科学实验中心)；LMWH(Alfa Wassermann公司)。

1.2实验方法各组仓鼠在造模前均禁食12 h，自由饮水。最终筛选出高脂饲料喂养的仓鼠后使用1%戊巴比妥钠(0.3 mg/100 g)腹腔麻醉，平卧固定，备皮、消毒、铺巾，经上腹部剑突下横行正中切口进腹，切口约2～3 cm，显露肝下间隙，暴露十二指肠，将十二指肠翻出体外。先找到肝总管，用无创血管夹夹闭近端，然后用密闭式静脉留置针(24GA×0.75IN Y型)从十二指肠壁进入胰胆管，向胰胆管内推进5 mm，见胆汁和胰液流出后，用细丝线在壶腹部乳头开口处结扎防止注射液回流；同时于胆总管上端用小动脉夹钳夹闭，防止注射液上行流入肝内，将3.5%牛磺胆酸钠溶液用微量注射泵恒速注入胰胆管内，用量1 ml/kg体重，以0.2 ml/min的速度注射完毕，保持压力8 min后除去血管夹，拔出针头。造模完毕，暂时关闭腹腔防止体液丢失。实验过程中小鼠背部皮下注射生理盐水补充血容量，维持中心静脉压(CVP)在0.532～0.798 kPa及心率(HR)、平均动脉压(MAP)波动范围在10%左右。术中胰腺出血、失血过多及死亡仓鼠被剔除出实验过程。造模后30 min时，充分显露腹主动脉主干，从腹主动脉插管至近肝动脉处，结扎固定，LAI+LMWH组注入LMWH 20 IU/kg使全身肝素化，LAI+saline组以同样的方法注入等量生理盐水，IV+LMWH组经静脉输注等量的LMWH，3组均经外周静脉注入吖啶橙靶向白细胞荧光染料(2 ml/kg)，注射完毕后以激光共聚焦显微镜荧光成像系统动态观察活体动物模型胰腺微循环，检测微循环血管平均直径(microvascular diameter，MVD)、功能性毛细血管密度(functional capillary density，FCD)及微循环血流速度(microvessel flow velocity，MFV)、白细胞黏附水平，记录数据。MVD：选取胰头部正中边长为0.5 cm的正方形区域为选定视野，应用图像分析系统分别测量所选取视野里各10个微循环毛细血管直径，最后求出平均值为微循环毛细血管直径(μm)；FCD：应用图像分析系统计算视野内功能性毛细血管密度(个/mm2)；MFV的测量：固定拍摄速度(capture speed)110 fps，回放速度(play speed)10 fps，回放录像，在监视器上找出目标微血管，采用阴极射线管群点扫描法进行速度测量(μm/s)；白细胞黏附：观察后微静脉血管内皮壁上黏附白细胞，白细胞移动缓慢超过30 s的定义为白细胞黏附，以每平方毫米血管壁黏附白细胞个数计算(个/mm2)。

1.3实验标本的获取及检测置动物于微循环观察盒中，以盐水棉棒轻柔，充分显露模型仓鼠胰体部(在胰体部选取和胰头、胰尾等距两点测定，测定时避开大血管或血肿处，最后取平均值作为结果)，分别在4、6 h后于激光共聚焦微循环显微镜下，活体观察吖啶橙靶向白细胞荧光染色后的胰腺微循环形态和血流动力学特点，并检测胰腺的MVD、FCD、MFV及白细胞黏附，根据不同染色时间、荧光强度、微循环血流速度对物镜、激光功率、探测针孔、扫描速度各参数综合调整选择，获得理想图像，固定扫描步进为5 pm，扫描深度100 pm，显微镜物镜放大倍数分别选取×10、×20，活体荧光成像系统进行图像采集、录像。试验后取胰腺组织100 mg，用 10%的甲醛固定，常规包埋切片，HE染色,在透视电镜下观察病理改变,由病理科医师按 Schimidt法进行胰腺组织病理学评分。

2 结果

2.1实验动物的基线数据各组仓鼠喂养高脂饲料后药物干预前的原始各观察指标的胰腺微循环变化情况，对比各组仓鼠喂养高脂饲料后的数据变化，3组饲养后体质量、血清(triglycerides,TG)、血清(amylase,AMS)及胰腺微循环各指标差异无统计学意义。见表1。

2.2造模后各观察指标变化情况与IV+LMWH 组及LAI+saline组相比，LAI+LMWH组大鼠的MVD、 FCD、MFV有明显的上升趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；LAI+LMWH组的白细胞黏附数较IV+LMWH 组及LAI+saline下降程度大，差异有统计学意义(P<0.05)；IV+LMWH组与LAI+saline组相比差异无统计学意义；与6 h时的LAI+LMWH组相比，4 h的LAI+LMWH组的MVD、FCD、MFV上升程度更明显。见表2、图1。

2.3血清三酰甘油和淀粉酶浓度测定及对比LAI+LMWH组血清TG水平较IV+LMWH组LAI+saline组显著下降(P<0.000 1)；LAI+LMWH组血清AMS水平较IV+LMWH组和LAI+saline组明显降低(P<0.000 1)。见表3。

2.4胰腺病理学评分LAI+LMWH组和IV+LMWH组胰腺病理学评分低于LAI+saline组，且LAI+LMWH组的下降程度较IV+LMWH组更大(P<0.000 1)。见表3。LAI+saline组胰腺组织中出现凝固性坏死、小叶结构消失、间质出血、水肿及中性粒细胞和单核细胞浸润的现象；IV+LMWH 组胰腺组织中出现的少量坏死灶、水肿及中性粒细胞和单核细胞浸润的炎症表现；LAI+LMWH组胰腺组织中无明显坏死及炎症细胞浸润，仅见少量水肿症状。见图2。

3 讨论

急性胰腺炎在国内发病率很高，近几年HLAP发病率呈明显上升趋势[4]。高脂血症性胰腺炎是继胆源性胰腺炎和酒精源性胰腺炎后的又一胰腺炎的常见病种，其发病率占急性胰腺炎发病率的1.3%～3.8%[1]。高脂血症根据Frederickson的脂蛋白电泳实验可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5种类型，其中Ⅰ、Ⅴ型以三酰甘油升高为显著特征，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ以单纯的胆固醇升高或合并轻微的三酰甘油升高为显著特征，且Ⅰ、Ⅴ型高脂血症并发急性胰腺炎的病例居多，因此可以肯定的是高三酰甘油血症较高胆固醇血症与急性胰腺炎的关系更为密切。其发病机制为普遍认可的游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)作用机制，该机制认为三酰甘油在激素敏感性三酰甘油脂肪酶的作用下生成FFA，且FFA不易溶于水，释放入血后与血浆清蛋白结合被输送到全身各组织利用，一般而言在正常情况下1分子清蛋白可与10分子的FFA结合。但是，当发生高三酰甘油血症时，代谢生成的FFA远远超过血浆清蛋白的结合能力，此时FFA大量过剩，就为导致胰腺炎的发生提供了物质基础。同时大量的FFA对胰腺的腺泡细胞和毛细血管内皮细胞有直接的细胞毒作用，其主要通过白介素(interleukin，IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子的生物膜细胞毒作用损伤其生物膜，导致细胞乃至细胞器肿胀变形和细胞膜通透性的增高，最后诱发和加重胰腺的损伤。另外，血液中较高的三酰甘油及FFA加重了血液的黏稠度，同时激活血小板，使其数量大大增加，这时血液自身阻力增大，血流速度缓慢，大量血液淤积于胰腺微循环内，血供受到严重影响。当然还可刺激血管产生缩血管物质血栓素A2(TXA2)，使得扩血管物质前列腺素I2明显减少，导致血管收缩、血栓形成、胰腺微循环障碍，进一步加重了胰腺的损伤。与此同时许多研究[5]显示，HLAP的发生与氧化应激有着一定的关联[5]。在氧化应激的过程中，由于活性物质的大量产生，可启动炎症网络系统，加重胰腺腺泡细胞的水肿和坏死，从而引起相应的组织功能障碍。

表1 各组仓鼠喂养高脂饲料后的体重、血清TG、AMS及MVD、FCD、MFV、白细胞黏附数的基线水平±s)

表2 各组仓鼠灌注LMWH和saline后MVD、FCD、MFV、白细胞黏附数比较±s)

表3 血清三酰甘油、淀粉酶水平及胰腺组织病理学评分±s)

图1 胰腺微循环各指标变化±s)与LAI+saline组比较：#P<0.05；与IV+LMWH组比较：+P<0.05；与6 h LAI+LMWH组比较：*P<0.05

图2 各组实验动物胰腺组织病理图 HE×200

肝素作为一种抗凝药物在临床上已广泛应用，其主要用于治疗和预防静脉血栓以及防止血栓的再发。目前临床上应用的肝素主要有两种：普通肝素和LMWH，而LMWH与普通肝素相比具有注射吸收好、半衰期长、生物利用度高、出血副作用少、无需实验室监测及抗血栓形成能力强等优点。最新研究[6]表明LMWH能与血管内皮细胞结合，保护血管内皮细胞，维持血管内皮细胞的完整性，促进内皮细胞分泌纤溶酶原激活物，抑制血栓素的活化，从而发挥纤溶和抗血栓作用。范钦桥 等[7]研究发现LMWH还可通过抑制核转录因子( NF-κB )的活性，从而诱导胰腺腺泡细胞的凋亡，减轻胰腺炎症程度。与此同时LMWH也可通过拮抗内皮细胞分泌内皮素-1，使微循环的稳定性增加，抑制胰腺分泌和胰酶活性，维持微循环通畅。

目前，在我国大多数的药物的给药途径多为静脉输注。但是，对于高脂血症性胰腺炎而言，静脉输注LMWH虽有一定的治疗效果，在药物经过体循环时，大部分被代谢及灭活，最后到达胰腺和胰腺周围组织的有效药物浓度大大减少[8]。对于高脂血症性胰腺炎患者，由于存在严重的胰腺微循环障碍，胰腺血流量减少，血流速度降低，血管阻塞，毛细血管血栓形成等，最终导致静脉输注的药物不能在胰腺组织内达到较高的有效治疗浓度[9]。相比而言，区域动脉灌注治疗可通过动脉导管使得LMWH直接到达病变部位，避免血胰屏障的损害，从而使得药物在胰腺内达到较高的治疗浓度。张世龙 等[10]研究发现，区域动脉灌注LMWH对胰腺炎的微循环障碍改善程度较静脉输注效果更加显著。顾凤元 等[11]测得区域动脉灌注时，抗生素在胰腺组织中的浓度是全身用药的3～4倍。本研究显示LAI+LMWH组与IV+LMWH组相比，LAI改善胰腺微循环障碍的效果更显著。因此，这也进一步说明了区域动脉灌注LMWH的优越性。对于LMWH的使用时间及使用剂量，至今仍未有统一的结论，多数类似实验中，LMWH的使用时间一般选择在造模后2 h或以后，而且剂量为300 IU/kg。而本实验中使用的LMWH(20 IU/kg)明显低于该数值，但仍取得良好的治疗效果，提示临床上可以通过更改输注方式提高药物疗效，减少药物使用剂量，从而避免潜在的药物副作用。

尽管LMWH治疗HLAP微循环障碍的实验有很多，但在活体直接观察胰腺微循环系统的报道相对较少，在本实验中利用激光共聚焦显微镜荧光成像技术动态观察活体动物模型胰腺微循环系统，发现早期区域动脉灌注LMWH对胰腺微循环障碍改善较静脉输注的效果更加显著，胰腺病理损伤评分明显降低，这也更好地为临床应用区域动脉灌注微量LMWH治疗HLAP提供了实验依据。

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