VEGF、TNF-α、miR-18a和MCM7在子宫肌瘤组织中的表达及临床意义

张冬红，刘恩令

(河北省唐山市工人医院妇产科 063000)

子宫肌瘤为女性生殖系统常见的一种良性肿瘤，可导致患者出现疼痛、盆腔压迫症状以及子宫异常出血等，对患者生育能力造成一定影响，且部分患者如不及时治疗可能会发生恶性病变[1]。了解子宫肌瘤发病原因及机制有助于更好地治疗本病，不过目前尚未完全清楚子宫肌瘤的发病机制。微小染色体维持蛋白(MCM)已被证实为机体的一种DNA复制管制复合物，MCM7为MCM家族重要成员，在多种疾病中呈高表达[2]。微小核糖核酸(miRNA)为广泛存在于真核生物细胞中非编码单链性的小分子RNA，在激素依赖性疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病发生和发展中起到了重要作用[3]。血管内皮生长因子(VEGF)是促血管生成因子的一种，在子宫肌瘤患者中其血清水平明显升高[4]。同时，子宫肌瘤与炎症有密切关系，炎症细胞浸润可能在子宫肌瘤发病中起到了重要促进作用[5]。本研究分析了VEGF、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、微小核糖核酸-18a(miR-18a)和MCM7在子宫肌瘤组织中的表达及临床意义，旨在为子宫肌瘤防治提供新的线索与依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2015年1月至2017年6月收治的43例行子宫肌瘤切除术患者的手术切除标本作为子宫肌瘤组织，距离子宫肌瘤至少1 cm处取子宫肌层组织作为正常子宫肌层组织。患者入选标准：(1)均行子宫肌瘤切除术；(2)均经病理学诊断为子宫肌瘤；(3)年龄在50岁以上；(4)绝经至少1年。排除标准：(1)入组前3个月使用过激素类药物者；(2)伴有恶性肿瘤者；(3)合并甲状腺疾病、糖尿病者；(4)合并子宫其他器质性病变者；(5)合并免疫系统疾病、感染性疾病者。43例患者年龄52～78岁，平均(67.32±5.29)岁；肌瘤直径3～14 cm，平均(7.89±2.06)cm；肌瘤数目1～5个，平均(1.83±0.45)个；肌瘤分型：浆膜下肌瘤11例，肌壁间肌瘤23例，混合型肌瘤9例。

1.2主要试剂 VEGF、TNF-α、MCM7抗体均购自英国Abcam公司，Has-miR-18a miRCURY LNA Detection probe以及地高辛标记LNA miR-18a均购自丹麦Exiqon公司，抗原修复液、二氨基联苯胺酶底物显色试剂盒、SP免疫组织化学染色试剂盒、Tris-HCl缓冲盐溶液、二氨基联苯胺、磷酸盐缓冲液均购自大连宝生物公司。

1.3方法

1.3.1标本采集及处理 以子宫肌瘤中心和肌瘤边缘连线的中间处选取直径2～10 cm的子宫肌瘤组织，距离子宫肌瘤至少1 cm处取子宫肌层组织，大小为1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm；标本采集完成之后，立即放置于10%中性甲醛溶液中内固定12～24 h，采取石蜡包埋法并连续切片，切片厚度为3～4 μm。

1.3.2miR-18a表达测定 通过原位杂交法测定miR-18a表达情况，将石蜡包埋组织石蜡并水化，取柠檬酸盐抗原进行修复，温度为49.5 ℃，取杂交缓冲液进行预杂交，时间为2 h，然后加入地高辛标记的miRCURY probes过夜。加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，水平为1∶200，孵育过夜，温度为4 ℃。取Tris-HCl缓冲盐溶液进行冲洗，在暗室中加入染色溶液，然后孵育24 h。达到预期亮度后将载玻片转移至终止液终止反应，进行苏木复染。

1.3.3VEGF、TNF-α、MCM7、孕激素受体(PR)、雌激素受体(ER)测定 取二甲苯将石蜡包埋、切片、脱蜡至去离子化，取乙二胺四乙酸修复缓冲液进行修复，然后打孔剂洗涤，采用3%过氧化氢进行室温孵育，时间为10 min，取磷酸盐缓冲液洗涤，再分别滴加一抗，孵育过夜，温度为4 ℃。再次取磷酸盐缓冲液进行洗涤，滴加二抗，孵育30 min，温度37 ℃。磷酸盐缓冲液洗涤后采用二氨基联苯胺进行显色，然后冲洗，取苏木素进行复染，采用洗洁精、梯度乙醇及中性树胶分别进行洗片、脱水及封片。

1.3.4表达结果评价 按照阳性细胞的比例进行结果判定，不染色或者阳性细胞比例在5%以下为阴性(-)；阳性细胞比例在10%～25%为弱阳性(+)；阳性细胞比例在>25%～50%为中等阳性(++)；阳性细胞比例在>50%，且染色分布呈弥散表现为强阳性(+++)。

2 结 果

2.1不同子宫组织各指标阳性表达结果比较 子宫肌瘤组织VEGF、TNF-α、MCM7、PR、ER阳性率分别为74.42%、62.79%、67.44%、79.07%和72.09%，均明显高于正常子宫肌层组织(P<0.05)；miR-18a阳性率为30.23%，明显低于正常子宫肌层组织(P<0.05)。见表1。

表1 不同子宫组织各指标阳性表达结果比较[n(%)]

2.2PR水平与VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a在子宫肌瘤组织中的相关性 Spearman相关分析结果显示，PR水平与VEGF、TNF-α、MCM7均呈正相关(P<0.05)，与miR-18a呈负相关(P<0.05)。见表2。

2.3ER水平与VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a在子宫肌瘤组织中的相关性 Spearman相关分析结果显示，ER水平与VEGF、TNF-α、MCM7均呈正相关(P<0.05)，与miR-18a呈负相关(P<0.05)。见表3。

表2 PR水平与VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a在子宫肌瘤组织中的相关性(n)

表3 ER水平与VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a在子宫肌瘤组织中的相关性(n)

2.4不同病例特征间VEGF、TNF-α、MCM7、PR、ER阳性率比较 肌瘤直径>8 cm、肌瘤数目>3个的VEGF、TNF-α、MCM7阳性率明显高于肌瘤直径≤8 cm、肌瘤数目≤3个的阳性率；肌瘤直径>8 cm、肌瘤数目>3个的miR-18a阳性率明显低于肌瘤直径≤8 cm、肌瘤数目≤3个的阳性率，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同年龄、肌瘤分型的VEGF、TNF-α、MCM7、PR、ER阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同病例特征间VEGF、TNF-α、MCM7、PR、ER阳性率比较[n(%)]

注：组内指标比较，aP<0.05

3 讨 论

子宫肌瘤发生及发展是多因素共同作用的结果，病因尚未完全明确。目前临床相关研究显示，该病属于甾体激素依赖性疾病，与细胞因子、基因、遗传、细胞信号传导途径异常，以及细胞增殖和凋亡等多种因素相关[6-7]。文献[8]报道，孕激素可以促进子宫肌瘤生长。孕激素和雌激素分别通过PR、ER发挥作用，由于PR、ER与孕激素和雌激素亲和力较高，能够选择性保留高水平的孕激素和雌激素，进而增强了生物学作用。本研究结果显示，子宫肌瘤组织PR、ER阳性率分别为79.07%和72.09%，明显高于正常子宫肌层组织，这与临床研究结果一致[9]，提示在子宫肌瘤的发展当中PR、ER发挥了重要作用。

VEGF属于糖基化多肽分泌因子的一种，由2个相同亚基以二硫键交联结合的形式组成。VEGF能够促进内皮细胞进行有丝分裂，增加机体血管的通透性，促进血管生成，在多种良恶性肿瘤新血管生成、血管重塑等过程中起到了重要作用[10]。本研究结果显示，在子宫肌瘤组织中VEGF阳性率为74.42%，明显高于正常子宫肌层组织的39.53%，这与高英芳等[11]的研究结果一致。本研究亦发现，在子宫肌瘤组织中VEGF表达水平与PR、ER表达呈正相关。孕激素与雌激素可以通过VEGF受体对多种和细胞增殖有关的基因表达进行调节，在子宫肌瘤新生血管以及内皮增生局部因子当中，VEGF的表达较强，而且VEGF提高了血管的通透性，这为多种细胞迁移提供了有利的纤维网络，进而促进了肌瘤的发展[12]。

TNF-α属于促炎因子的一种，能够促进T细胞产生多种炎症因子，进而诱发炎性反应。吞噬细胞在活化之后可以分泌大量的TNF-α，从而加剧了局部平滑肌组织的损伤，进而形成了炎症病理损伤。同时，TNF-α还能够通过对VEGF表达进行调节，从而间接发挥促进血管形成的作用[13]。唐恩燕等[5]的研究指出，在子宫肌瘤组织中TNF-α表达量明显高于正常子宫肌层组织，这可能与炎症产物对单核吞噬细胞进行刺激，进而导致TNF-α分泌量增加，以及子宫肌瘤细胞自身分泌TNF-α等有关。本研究结果与以上研究一致，子宫肌瘤组织中TNF-α阳性率为62.79%，明显高于子宫肌层组织的25.58%，同时TNF-α表达水平与PR、ER亦呈显著正相关。

miRNA被包裹在凋亡小体、微小体或者外泌体之中，它们与血浆中小分子物质在化学修饰作用下形成囊泡及蛋白复合体，而膜性结构可避免miRNA在机体内被降解，形成的复合物进入机体后被转运至受体细胞，然后通过内吞、膜融合、受体结合等方式发挥生物学效应[14]。近年来，随着临床基因组学研究逐步深入，人们对于miRNA与肌瘤的关系有了全新的认识，越来越多的学者发现，子宫肌瘤与miRNA有着密切关系，多种miRNA如miR-21、miR-197、miR-29b以及let-7等在子宫肌瘤组织中出现明显的异常表达现象，它们通过作用于不同的靶基因，进而在子宫肌瘤发生及发展中发挥重要作用[15]。ER包括两种亚型，分别为ERα和ERβ。在廖治等[16]的研究中指出，miR-18a表达降低，而ERα表达升高，二者呈负相关，并指出miR-18a的靶基因可能为ERα。本研究结果显示，子宫肌瘤组织中miR-18a阳性率为30.23%，明显低于子宫肌层组织的83.72%，且与PR、ER表达均呈明显负相关。其表达失调可能促进了子宫肌瘤细胞增殖，进而促进了子宫肌瘤进展。

肿瘤与细胞周期之间有着密切关系，细胞周期和DNA复制调控有关。MCM为一组与细胞增殖和DNA复制有关的蛋白家族，在基因组、染色体重构及DNA复制中起到了重要作用。在细胞中MCM蛋白表达量呈现周期性的表现，当处于G1/S转换时MCM蛋白表达量达到峰值，而当细胞G0期或者分化期时，MCM蛋白表达量明显降低，甚至不表达。因此，MCM蛋白可以作为细胞增生状态评估的一个重要特异性标志物[17]。MCM7是MCM家族重要成员，在确保DNA复制起始过程稳定中起重要作用，能够保证在一个周期之中DNA复制仅有1次，因此MCM7表达水平提高说明细胞增生、增殖明显进展[18]。本研究中，子宫肌瘤组织MCM7阳性率为67.44%，明显高于的瘤旁组织的16.28%，而且与PR、ER高表达相关。进一步分析发现，在子宫肌瘤组织中，肌瘤直径>8 cm、肌瘤数目>3个的VEGF、TNF-α、MCM7阳性率明显高于肌瘤直径≤8 cm、肌瘤数目≤3个的阳性率，而miR-18a阳性率明显低于肌瘤直径≤8 cm、肌瘤数目≤3个的阳性率，可见不同肌瘤大小、数目之间VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a阳性率存在明显差异。随着肿瘤大小增加，以及肿瘤数目增多，VEGF、TNF-α、MCM7阳性率逐渐升高，而miR-18a阳性率逐渐降低，提示VEGF、TNF-α、MCM7高表达及miR-18a低表达与子宫肌瘤发生及发展可能存在密切关系。

综上所述，在子宫肌瘤组织中VEGF、TNF-α、MCM7均呈高表达，miR-18a呈低表达，其异常表达与子宫肌瘤发生及发展密切相关。VEGF、TNF-α、MCM7、miR-18a异常表达可以筛检子宫肌瘤的高危人群。不过本研究的样本量偏少，应扩大样本量进一步证实。

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