淫羊藿破壁饮片薄层鉴别研究

贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb. et Zucc. ) Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥叶，是我国常用中药之一，主要用于治疗肾阳虚衰，阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛等症[1]。现代药理研究表明淫羊藿对免疫系统、心脑血管系统、生殖系统、骨骼系统、内分泌系统、血液系统、肿瘤等均有一定的作用[2]。当前，尚没有对淫羊藿破壁饮片薄层鉴别进行系统的文献研究，因此，为了能更好地控制其质量，确保其临床应用的安全性和有效性，笔者以淫羊藿苷作为对照品，从提取方法、展开系统、显色方法等方面对淫羊藿破壁饮片的薄层鉴别方法进行了探索，以期拟定出淫羊藿破壁饮片的薄层鉴别方法，进而完善淫羊藿破壁饮片的质量标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器 GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；ATY224型电子分析天平(Shimadzu cororation)；ZF-1型三用紫外仪(邦西仪器科技有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，微量进样器(20 μL)。

1.2 材料 淫羊藿破壁饮片(批号：20171001，20171002，20171003，20171004，20171005自制)、淫羊藿(经贵阳中医学院徐剑教授鉴定为药典上收载的淫羊藿，相关信息见表1)，淫羊藿对照药材(批号：121632-201502，中国食品药品检定研究院)、淫羊藿苷对照品(批号：110737-201516，中国食品药品检定研究院)；无水氯化铝(批号：20170201，国药集团化学试剂有限公司)、硫酸(批号：20170301，重庆川东化工有限公司)、乙酸乙酯(批号：1601101，上海申博化工有限公司)、丁酮(批号：20160826，天津科密欧有限公司)、甲酸(批号：2060625，天津科密欧有限公司)、磷酸(批号：20160401，重庆川东化工有限公司)、醋酸(批号：1703101，上海申博化工有限公司)、氯仿(批号：20170301，西陇科学有限公司)、无水乙醇(批号：20170201，国药集团化学试剂有限公司)等均为分析纯。

硅胶H板(规格：100 mm×100 mm，批号：20150917，青岛海洋化工厂)、硅胶H板(规格：50 mm×100 mm，批号：20150917，青岛海洋化工厂)；硅胶G板(规格：100 mm×100 mm，批号：20160321，青岛海洋化工厂)、硅胶G板(规格：50 mm×100 mm，批号：20160321，青岛海洋化工厂)。

表1 淫羊藿批号、产地来源及采收期

2 方法与结果

2.1 提取方法的考察 分别称取本品0.5 g，参考相关文献[1，3-5]，按下述方法处理：①加乙醇10 mL，温浸30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇l mL使溶解，作为供试品溶液；②加乙醇10 mL，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；③加70%乙醇10 mL，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；④加50%乙醇10 mL，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；⑤加石油醚(30～60℃)20 mL回流提取30min，滤过，挥去石油醚，残渣加乙醇10超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇l mL使溶解，作为供试品溶液；⑥加热水10 mL，超声30min，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取两次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；⑦加乙醇10 mL，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10溶解，石油醚洗涤，每次10 mL，水液层用乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.099 mg/mL的溶液，即得对照溶液。取上述各供试品溶液、对照品溶液各10 μL，点于同一硅胶H薄层板上，以甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸(3∶6∶5∶1∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试验，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。结果见图1。研究显示方法①、②和⑤斑点不清晰，且方法①存在严重拖尾，斑点未分开等现象，方法③和④则比方法①、②、⑤、⑥和⑦斑点都较清晰且分离效果较好，原因可能是当淫羊藿采取单独的乙醇提取时，所提取出来的成分较多，干扰因素较大，故出现拖尾或分不开的现象，当增加石油醚去色或除杂时，也带走了部分目标成分，薄层斑点显色就不是很明显，而方法③和④则采取一定比例的乙醇既最大化提取出目标成分，又通过后续的水溶解乙酸乙酯萃取，除去多糖等杂质成分，使得杂质成分较少，斑点显色清晰，另外，文献研究表明方法④所提取出来的淫羊藿苷成分较高[6]，故选取方法④为淫羊藿破壁饮片鉴别的提取方法。

2.2 展开系统的考察 取淫羊藿破壁饮片按提取方法④分别制成供试品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各10μL，点于薄层板上，参考相关文献基础之上[7-8]，分别在下述各展开系统中展开：①乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)；②甲醇-丁酮-三氯甲烷-水(4∶6∶6∶1)；③氯仿-甲醇-丁酮(1∶2∶2)；④氯仿-甲醇-水(13.5∶6∶2)静置至澄清的下层溶液；⑤甲醇-丁酮-氯仿-水(3∶6∶5∶1)；⑥甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸(3∶6∶5∶1∶0.2)。结果见图2。研究显示展开系统⑥展开的薄层板斑点清晰，且分离显色效果最好，因此选择展开系统⑥作为展开条件。

2.3 显色方法的考察 取淫羊藿破壁饮片按照2.1项下提取方法④制成供试品溶液，再按照2.2项下展开系统⑥展开，然后分别喷上以下三种显色试液进行考察，再置紫外光灯(365 nm)下检视：①三氯化铝试液；②5%三氯化铁乙醇溶液；③5%硫酸乙醇溶液。结果见图3。研究显示三种显色方法都有较好的显色效果，但方法①显色斑点最为明亮，且清晰易见，因此选择显色方法①作为显色方法。

2.4 点样量的考察 取淫羊藿破壁饮片按2.1项下提取方法④制备供试品溶液，然后按2.2项下展开系统⑥展开，2.3项下显色方法①显色，考察点样量(2、6、8、10、14、18μL)对淫羊藿破壁饮片薄层斑点显色效果的影响，结果见图4。研究显示，当样品点样量为2μL时，由于浓度过低，斑点能见但不清晰，而当点样量为6～10μL时，斑点比较清晰，增大到14、18μL时，由于浓度增大，产生了拖尾现象，因此，选择6～10μL作为点样量。

2.5 预饱和时间的考察 干燥薄层板和展开剂蒸汽间的平衡主要表现在从展开开始至结束过程中薄层对展开剂蒸汽的预吸附，而薄层各个部分项吸附的程度是不同的。当用多元展开剂时，又将发生选择性吸附现象，这些都会影响色谱分离。因此在用多元展开剂时，经常将薄层及展开室进行预饱和，以便得到重现的薄层色谱图。因此，本实验考察了不同预饱和时间(15、20、25、30 min)对淫羊藿破壁饮片薄层斑点显色效果的影响。结果显示，预饱和时间在15～30 min时，对淫羊藿破壁饮片薄层色谱显色效果影响不明显，显色效果均较好、斑点清晰可见，且边缘效应较小，因此，选择预饱和时间15 min即可。

2.6 耐用性考察

2.6.1 薄层板的考察 为考察薄层板对淫羊藿破壁饮片薄层色谱斑点的影响，分别对不同规格的硅胶H板(100 mm×100 mm，50 mm×100 mm)、硅胶G板(100 mm×100 mm，50 mm×100 mm)，进行考察，结果见图5，研究显示，硅胶H板薄层斑点显示效果整体上比G板好，且硅胶G板薄层斑点上端均存在一定的边缘效应，因此，选择硅胶H板作为薄层板。

2.6.2 温度的考察 为考察不同温度对淫羊藿破壁饮片薄层色谱斑点的影响，分别考察了不同温度(2、10、20、30、35、40℃)对淫羊藿破壁饮片薄层色谱斑点的影响。结果显示，展开环境温度在10℃～30℃时，显色效果分离度均较好、斑点清晰可见，没有明显的差异。当低于2℃，由于展开剂温度过低，导致展开时间过长，效率较低，当高于40℃时，部分易挥发的展开剂出现了挥发的现象，导致展开系统中内部环境存在极性分布不均匀或不等的现象，导致薄层斑点不清晰以及拖尾和边缘效应等现象，因此，温度应控制在10～35℃。

2.6.3 相对湿度的考察 薄层板在存放或活化后在点样过程中，吸附剂表面能可逆地吸收水分，如空气湿度过大，薄层活度会降低，影响分离效果，因此，本研究考察了相对湿度(32%、42%、58%、65%、72%、88%)对淫羊藿破壁饮片薄层色谱显色效果的影响。结果显示，相对湿度高于72%以上时，由于薄层板过多吸收水分，斑点拖尾，对照品与样品斑点不在同一位置，不能有效地进行鉴别，而相对湿度在32%～72%时，斑点清晰，分离度较好，对照品与样品斑点在同一位置，能有效地进行鉴别，因此相对湿度应控制在32%～72%。

2.7 淫羊藿破壁饮片薄层鉴别 取本品0.5 g(5批样品，批号见表1)，精密称定，置锥形瓶中，加50%乙醇10 mL，超声30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水10 mL溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.099 mg/mL的溶液，即得对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液6～10 μL和0.099 mg/mL淫羊藿苷对照品溶液10 μL，分别点与同一块硅胶H板上，以甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸(3∶6∶5∶1∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干喷以三氯化铝试液，再置紫外光灯(365 nm) 下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙红色荧光斑点。5批样品均能鉴别出淫羊藿苷，且斑点清晰可见，结果见图6。

3 讨论

淫羊藿作为我国常用中药之一，《中国药典》2015年版一部淫羊藿项下已有以淫羊藿苷为对照品建立的薄层色谱鉴别方法，然而，经笔者多次验证，采用药典展开系统及提取方法所做的薄层鉴别图，显色效果不佳，存在一定拖尾、扩散、边缘效应等现象，且重复性不佳。因此，笔者从提取方法、展开系统、显色方法等方面对淫羊藿破壁饮片的薄层鉴别进行了系统的研究，最终优选出文中的薄层鉴别方法，该方法简便、可行、斑点清晰，易于检出，且分离效果较药典方法好，专属性强，为更好地控制淫羊藿破壁饮片质量提供了科学依据。

在预试和正式实验中，样品溶液的提取分别考察了提取溶剂(水、乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙酸乙酯等)、提取方法(温浸、回流、超声)、提取时间(15、30、45 min)，结果显示，50%乙醇超声30 min，然后采用乙酸乙酯萃取处理的提取的样品溶液所做的薄层斑点清晰可见，分离度好，斑点较多；展开系统分别考察了乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)、甲醇-丁酮-三氯甲烷-水(4∶6∶6∶1)、氯仿-甲醇-丁酮(1∶2∶2)、氯仿-甲醇-水(13.5∶6∶2)静置至澄清的下层溶液、甲醇-丁酮-氯仿-水(3∶6∶5∶1)、甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸(3∶6∶5∶1∶0.2)等，研究显示，甲醇-丁酮-氯仿-水-甲酸(3∶6∶5∶1∶0.2)展开系统比较佳，其斑点清晰可见，分离度好，斑点较多，边缘效应较小等；显色方法考察了三氯化铝试液、5%三氯化铁乙醇溶液、5%硫酸乙醇溶液三种，结果三氯化铝试液斑点显色最为清晰可见；考察点样量时，最终选择6～10 μL的点样量，过低多高均会影响其显色效果；耐用性试验中分别考察了温度、湿度、薄层板对薄层斑点显色效果的影响，结果显示，本文中所摸索出来的薄层方法在一定的条件下，适用性较好。

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