急腹症Ⅲ号对呼吸机相关性肺炎大鼠小肠形态的影响

王瑞明

[摘要] 目的 觀察急腹症Ⅲ号对呼吸机相关性肺炎模型大鼠小肠形态的影响，并探讨其作用机制。 方法 雄性SD大鼠100只，随机分为五组：急腹症Ⅲ号组（VAP模型，急腹症Ⅲ号灌胃）、谷氨酰胺组（VAP模型，谷氨酰胺颗粒灌胃）、急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组（VAP模型，急腹症Ⅲ号及谷氨酰胺颗粒灌胃）、安慰剂组（VAP模型，生理盐水灌胃）、空白对照组（生理盐水灌胃）。术后第5天收集尿液，采用L/M（乳果糖/甘露醇法）评价肠黏膜通透性，术后第6天处死大鼠取小肠进行病理检测。 结果 安慰剂组L/M较空白对照组明显增大（P<0.01），其余三个干预组与空白对照组相似。安慰剂组小肠绒毛高度、黏膜厚度及全层厚度均低于空白对照组（P<0.01）。三个干预组小肠绒毛高度与空白对照组相似（P>0.05），且均高于安慰剂组（P<0.01），联合组绒毛高度高于急腹症Ⅲ号组及谷氨酰胺组（P<0.01），但急腹症Ⅲ号组与谷氨酰胺组之间差异无统计学意义（P>0.05）。空白组黏膜厚度与急腹症Ⅲ号组及联合组相似（P>0.05），但高于谷氨酰胺组（P<0.05），三个干预组均高于安慰剂组（P<0.01），但三组之间无差异（P>0.05）。联合组全层厚度高于安慰剂组（P<0.01），其余组之间无统计学差异（P>0.05）。 结论 急腹症Ⅲ号可减少呼吸机相关性肺炎大鼠模型肠黏膜通透性增加，减少小肠黏膜结构的破坏，保护肠黏膜结构。

[关键词] 急腹症Ⅲ号；呼吸机相关性肺炎；肠道通透性；黏膜结构

[中图分类号] R259 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）03-0030-04

Effect of acute abdomen No.Ⅲ on small intestine morphology of rats with ventilator-associated pneumonia

WANG Ruiming

Department of Emergency， Hangzhou Hospital of TCM， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To observe the effect of acute abdomen No.Ⅲ on small intestine morphology in rats with ventilator-associated pneumonia and to explore its mechanism. Methods A total of 100 male SD rats were randomly divided into 5 groups. Acute abdomen No.Ⅲ group： VAP model， acute abdomen No.Ⅲ gavage； glutamine group： VAP model， glutamine granules gavage； acute abdomen No.Ⅲ combined with glutamine group： VAP model， acute abdomen No.Ⅲ and glutamine granules gavage； placebo group： VAP model， normal saline gavage； blank control group： normal saline gavage. Urine was collected on the 5th day after surgery. L/M （lactulose/mannitol method） was used to evaluate the intestinal mucosal permeability. The rats were sacrificed on the 6th day after surgery to collect the small intestine for pathological examination. Results L/M in placebo group was significantly higher than that in blank control group（P<0.01）， and L/M in the other three intervention groups were similar to that in the blank control group. The small intestine villi height， mucosal thickness and full thickness in the placebo group were all lower than those in the blank control group（P<0.01）. The small intestine villi height in the three intervention groups was similar to that in the blank control group （P>0.05）， and were all higher than that in the placebo group（P<0.01）. The villus height in the combined group was higher than that in the acute abdomen No.Ⅲ group and glutamine group（P<0.01）. However， there was no difference between acute abdomen No.Ⅲ group and glutamine group（P>0.05）. The mucosal thickness in the blank group was similar to that in the acute abdomen No.Ⅲ group and the combined group（P>0.05）， but higher than glutamine group（P<0.05）. The three intervention groups were higher than placebo group（P<0.01）. However， there was no difference between the three groups（P>0.05）. The total thickness in the combined group was higher than that in the placebo group（P<0.01）， there was no statistically significant difference between the other groups（P>0.05）. Conclusion Acute abdomen No.Ⅲ can reduce the increase of intestinal mucosal permeability in rats model with ventilator-associated pneumonia， reduce the destruction of intestinal mucosal structure and protect the structure of intestinal mucosa.

[Key words] Acute abdomen No.Ⅲ； Ventilator-associated pneumonia； Intestinal permeability； Mucosal structures

肠道是机体最大的细菌和毒素库[1]，多种原因可导致肠道菌群失调，屏障功能破坏，动力丧失，有可能成为呼吸机相关性肺炎（VAP）患者菌血症来源，最终发展成为多器官功能障碍综合征（MODS）[1，2]。祖国医学认为肺与大肠相表里，互为络属，互相影响，肺气不降，津不下达，则腑气不通。大肠实热，腑气阻滞，亦可影响肺的宣降。急腹症Ⅲ号是我院院内制剂，其基本成分为生大黄、川朴、枳壳、丹参、川芎、生山栀、蒲公英，主要根据《伤寒论》大承气汤加减化裁而成，具有泄热通腑，清热解毒等功效，临床上多应用于热瘀所致的腑实证。本研究基于“肺肠表里”理论，旨在观察院内制剂急腹症Ⅲ号对呼吸机相关性肺炎大鼠小肠结构的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

100只体重280～320 g的雄性SD大鼠[上海西普尔必凯实验动物有限公司生产，生产批号：SCXK（沪）2013-0016；实验动物使用许可证号：浙江中医药大学动物实验研究中心，SYXK（浙）2013-0184]。

1.2 实验设备

光学显微镜Olympus，石蜡切片机RM2135型，低温高速离心机Beckman，SX-300S凝胶图像分析处理系统（上海小源科技有限公司），高效液相色谱仪（美国water公司），精密电子天平（Sartorius公司），电泳仪（Bio-RAD公司），代谢笼等。

1.3 实验药品及试剂

（1）急腹症Ⅲ号（其基本成分为生大黄、川朴、枳壳、丹参，川芎、生山栀、蒲公英等），由杭州市中医院制剂室提供（批准文号：浙药制字Z20100112）。

（2）谷氨酰胺（日本寿制药株式会社）：等氮量的谷氨酰胺0.3 g/kg每日灌胃。

（3）乳果糖标准品（上海源叶生物科技有限公司）和甘露醇标准品（国药集团化学试剂有限公司）。

1.4 VAP造模方法[3]及造模成功的标准[3]

（1）经口气管插管：用16和18号静脉套管针制备气管导管。大鼠麻醉前禁食12 h。用质量分数20%的乌拉坦腹腔注射麻醉，用消毒小纱布将舌向左外侧上方轻轻拉出，头部尽量向上抬起，同时上下颌分开。在额戴式喉镜反射光照射下对准声门旋转插入自制气管导管，插入深度为套管针尾部与牙齿平齐。观察棉絮在气管导管口的起伏并用听诊器听双肺呼吸音以确定导管在气管内，将气管导管外层与大鼠上唇缝合固定，连接动物呼吸机控制呼吸。呼吸机参数设定为；潮气量（V）12 mL/kg，呼吸频率70次/min，吸入氧浓度（FiO2）1.0。为防止体位引起的肺不张，每隔30 min行2～3次大V通气。股静脉插管，以3～5 mL/h输入质量分数为5%的葡萄糖盐水。

（2）大鼠VAP模型制备：每只大鼠机械通气24 h（无需使用肌松剂）后，竖起固定板>45°，以微量注射器快速注入0.2 mL 3×108 cfu/L铜绿假单胞菌（PA）菌液和0.55 mL气体，并保持体位5 min。

（3）造模成功的标准：出现肺炎临床表现；大鼠肉眼观察肺叶可见不同程度的融合性出血性病灶；大鼠肺组织光镜下观察呈小叶性肺炎特征；外周血和肺泡灌洗液（BALF）细菌学培养阳性。

1.5 分组及给药方法

将雄性SD大鼠随机分为五组：（1）急腹症Ⅲ号组：大鼠VAP模型，每日灌胃急腹症Ⅲ号2 mL×5 d。（2）谷氨酰胺组：大鼠VAP模型，每日灌胃谷氨酰胺颗粒2 mL×5 d。（3）急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组（联合组）：大鼠VAP模型，灌胃急腹症Ⅲ号及谷氨酰胺颗粒各2 mL×5 d。（4）安慰剂组：大鼠VAP模型，每日灌胃生理盐水2 mL×5 d。（5）空白对照组：无特殊处理，每日灌胃生理盐水2 mL×5 d。

1.6 检测项目及方法

肠道通透性：术后第5天，经口灌胃乳果糖+甘露醇混合液2 mL，转代谢笼收集24 h尿液。取10 mL尿液加硫柳汞2 mL置-20℃冰箱保存。用HS色谱工作站对色谱图形进行积分处理。计算得出L/M（乳果糖/甘露醇）。

肠道形态学：术后第6天处死大鼠，保持无菌状态，在距离屈氏韧带5 cm处剪取10 cm肠段，用0.1 M磷酸盐缓冲液冲洗干净，其中取2 cm用10%甲醛固定，标本经脱水，石蜡包埋，切片进行常规HE染色，做光镜检查。观察组织病理学变化，以均数的绒毛高度、黏膜厚度及全层厚度作为测定数据。

1.7统计学方法

用SPSS 17.0统计学软件对数據进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，通透性检测用单因素方差分析及Dunnetts法进行两两比较，组间数据比较采用方差分析，治疗前后比较采取自身对照t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠L/M（乳果糖/甘露醇）比较的单因素方差分析

单因素方差分析结果显示，术后第5天五组24 h尿液L/M不全相同（F=19.43，P<0.01）（表1）。进一步采用Dunnetts法进行两两比较，结果显示，安慰剂组L/M高于空白对照组（P<0.01），其余三组则与空白对照组相似，均低于安慰剂组（P<0.01）。见表1。

2.2各组大鼠肠道形态学变化

安慰剂组小肠萎缩明显，绒毛肿胀破坏严重，短而稀疏；黏膜变薄，黏膜下有炎性细胞浸润，肠腺显著减少，分布密度显著降低。安慰剂组黏膜厚度、小肠绒毛高度及全层厚度均低于空白对照组（P<0.01）。绒毛高度：急腹症Ⅲ号组、谷氨酰胺组及急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组小肠绒毛高度与空白对照组相似（P>0.05），且均高于安慰剂组（P<0.01），急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组绒毛高度高于急腹症Ⅲ号组及谷氨酰胺组（P<0.01），但急腹症Ⅲ号组与谷氨酰胺组之间无差异（P>0.05）。黏膜厚度：空白组与急腹症Ⅲ号组、急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组相似（P>0.05），但高于谷氨酰胺组（P<0.05），急腹症Ⅲ号组、谷氨酰胺组及急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组均高于安慰剂组（P<0.01），但三组之间无差异（P>0.05）。全层厚度：急腹症Ⅲ号联合谷氨酰胺组高于安慰剂组（P<0.01），其余各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

呼吸机相关性肺炎（VAP）是指应用机械通气治疗后48 h和停用机械通气拔除人工气道48 h内发生的肺实质的感染性炎症。呼吸机相关性肺炎的病因和发病机制较多，肠道菌群的移位及肠功能衰竭对VAP显得尤为重要[4]。患者病情越重，肠道通透性越高，而通透性增高又加重病情[5]。细菌移位[6]是指胃肠道内寄生菌通过某些通道进入正常无菌组织，如肠系膜淋巴结和其他脏器，其实移位应包括所有微生物及其产物如内毒素等。细菌移位的机制包括肠黏膜屏障的损伤、萎缩及机体免疫功能的下降及肠道菌群失调等[7]。故肠道通透性增高可反映早期肠屏障的损伤[8]，本实验通过监测实验大鼠尿液中L/M及小肠绒毛高度、黏膜厚度和全层厚度来判断急腹症Ⅲ号保护肠黏膜损伤的情况。

中医学认为“肺与大肠相表里”。肺与大肠的表里关系主要体现在肺气的肃降和大肠传导相互为用的关系。肺气肃降，气机条达，布散津液，有利于糟粕的排出，同理大肠传导正常，糟粕下行，也有利于肺气的肃降。呼吸机相关性肺炎以腑实证候为多，基于“肺肠表里”理论治疗取得了一定的疗效[9]。急腹症Ⅲ号是我院院内制剂，其基本成分为生大黄、川朴、枳壳、丹参、川芎、生山栀、蒲公英等。主要是根据《伤寒论》大承气汤加减化裁而成，具有泄热通腑，清热解毒等功效，临床上多应用于热瘀所致的腑实证。中医认为“六腑以通为用”，六腑传化水谷，需不断收纳、消化、传导和排泄，虚实更替，宜通而不宜滞，因此通腑法在腑气不通及胃肠功能受损方面屡有见效。方中大黄为君，苦寒泄热，祛瘀通便。大黄作为通腑要药在《神农本草经》中早有记载：“荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏”。厚朴、枳壳为臣，行气除胀，消积导滞，辅以丹参、川芎、生山栀、蒲公英活血祛瘀行气之功。

现代药理研究表明大黄制剂能够明显促进胃肠蠕动，减轻肠源性内毒素[10]，对肠道的机械屏障、免疫屏障和生物屏障有保护作用[11]。本院院内制剂急腹症Ⅲ号的药理研究表明其具有抗凝，抑制血小板黏附、聚集、释放，扩张血管的作用，保护肠黏膜屏障功能，减少细菌易位，改善肠黏膜微循环的作用[12]。

谷氨酰胺对危重患者的肠道保护作用已初步得到肯定[13-14]，它可以减轻肠屏障损害，抑制内毒素和细胞因子的产生，防止肠源性感染[15]，抑制小肠黏膜萎缩[16]。小肠绒毛是固有层和上皮共同凸向肠腔形成的叶状结构，是小肠壁内大量环形皱襞上的绒毛状的突起。氨基酸、葡萄糖、无机盐等的吸收都在小肠绒毛上皮细胞，如果其受损，将影响营养物质的吸收。小肠绒毛高度、黏膜厚度及全层厚度可以直接反映小肠黏膜的损害。在本研究中，我们联合使用了谷氨酰胺和急腹症Ⅲ号，这在过去的研究中尚未有先例。从大量的实验研究和本实验研究结果看，谷氨酰胺和急腹症Ⅲ号具有很多类似的肠道保护作用，但是作用机制不尽相同。谷氨酰胺作为条件必需氨基酸，可以为小肠细胞供能，修复肠黏膜[17]。S-IgA的合成和分泌也离不开谷氨酰胺[18]。最近研究认为谷氨酰胺能上调ZO-1蛋白，该保护作用与抗氧化应激反应有关[19]。而急腹症Ⅲ号是传统中药，其基本成分为生大黄、川朴、枳壳、丹参、川芎、生山栀、蒲公英等。因其为复方制剂，作用靶点较多，药理作用也比较复杂。研究表明大黄制剂可以增加胃肠蠕动，促进毒素和细菌的排泄，从而对胃肠黏膜起到保护作用；能拮抗TNF-a、IL-6、IL-8和内毒素等炎症介质[20]。

本实验通过急腹症Ⅲ号与谷氨酰胺的对比研究发现呼吸机相关性肺炎模型增加肠道通透性，破坏了大鼠小肠黏膜结构，表现为小肠萎缩明显，绒毛肿胀破坏，绒毛短而稀疏，黏膜变薄，黏膜下炎性细胞浸润。急腹症Ⅲ号及谷氨酰胺可阻止大鼠小肠黏膜结构的破坏，保护肠黏膜结构，减少细菌移位，早期联合谷氨酰胺的机制考虑是谷氨酰胺改善了肠黏膜细胞的饥饿状态，保证免疫细胞的增生和免疫球蛋白的生物合成，防止细菌移位及内毒素入血，维持肠道屏障。但是本实验样本量较小，需要进一步大样本的研究证实。

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（收稿日期：2017-10-16）