BSEP在辅助生殖技术助孕的ICP患者胎盘中的表达及意义

刘林丽 张良晨 朱思远 齐碧如 黄勉

[摘要] 目的 探討胆盐输出泵（BSEP）在ART助孕和正常受孕妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）患者胎盘组织中的表达及意义。 方法 采用Western blot和RT-PCR方法检测我院收治的15例自然受孕ICP患者（ICP组）、15例ART助孕ICP患者（ART组）及9例正常妊娠患者（对照组）胎盘组织中 BSEP蛋白和mRNA 的表达情况，分析三组ICP胎盘中BSEP表达的差异。 结果 Western blot和RT-PCR法显示BSEP蛋白和mRNA在自然受孕ICP胎盘中表达分别为（0.443±0.102）和（8.139±4.490），在ART来源胎盘中表达分别为（0.490±0.117）和（9.992±5.253），而正常妊娠胎盘组织中表达明显减少（0.161±0.013）和（1.038±0.271），ICP组和ART组差异无明显差异（P>0.05），而这两组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.001）。 结论 BSEP 蛋白在正常妊娠胎盘组织中微量表达，而在 ICP 患者胎盘组织中高表达，可能与 ICP的发病有关，但自然受孕ICP胎盘和ART助孕ICP胎盘中BSEP 蛋白无差异，提示ART助孕并不增加子代妊娠期ICP的发病风险。

[关键词] 辅助生殖技术；蛋白质印迹法 ；妊娠期肝内胆汁淤积症；反转录·聚合酶链反应；胆盐输出泵

[中图分类号] R715.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）03-0008-04

Significance and expression of BSEP in placenta of ICP patients treated with assisted reproductive technology

LIU Linli ZHANG Liangchen ZHU Siyuan QI Biru HUANG Mian

Department of Obstetrics and Gynecology， Fuzhou First Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350004， China

[Abstract] Objective To explore the significance and the expression of bile salt export pump（BSEP） in placenta of patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy（ICP） of natural conception or pregnancy through ART treatment. Methods The expression of BSEP proteion and mRNA in placenta of 15 ICP patients of natural conception（ICP group）， 15 ICP patients treated with ART（ART group） and 9 normal cases of natural conception（control group） attended our hospital was detected by Western blot and RT-PCR. The difference of BSEP expression in three groups of ICP placenta was analyzed. Results The Western blot and RT-PCR showed that the expression of BSEP protein and mRNA in ICP placenta of natural conception was （0.443±0.102） and （8.139±4.490）， respectively. The expression in the placenta of ART group was （0.490±0.117） and （9.992±5.253）， respectively. The expression in the placenta of control group was significant less， which was （0.161±0.013） and （1.038±0.271）， respectively. There was no significant difference between ICP group and ART group（P>0.05）， but both of them showed statistically significant difference compared to control group（P<0.001）. Conclusion Trace expression of BSEP protein was found in placenta tissue of normal pregnancy， while high expression in placenta tissue of ICP patients implicated that BSEP protein may related to the occurence of ICP. There was no difference in expression of BSEP protein in ICP placenta between natural conception and pregnancy with ART treatment， which suggested that ART will not increase the risk of ICP in offspring.

[Key words] Assisted reproductive technology； Western blot； Intrahepatic cholestasis of pregnancy； RT-PCR； Bile salt export pump

辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）广泛应用于临床，其大量超生理的操作是否会增加子代不良健康风险目前仍无定论。和自然妊娠相比，ART可能造成妊娠期合并症、出生缺陷、低出生体质量儿、早产、神经发育异常甚至癌症等不良妊娠结局[1-2]。胎盘是连接母胎的重要器官，对ART来源胎盘的研究，有利于我们更好地评估ART安全性。数据显示，妊娠期肝内胆汁淤积症（Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是对母儿危害极大，世界各地发病率差异较大，中国女性似乎更高发，提醒我们必须要重视ICP与ART的研究。BSEP基因是肝细胞毛细胆管侧的胆汁酸载体，有数据表明胆盐输出泵（bile salt export pump，BSEP）是ICP的易感基因，可能参与ICP的发病[3-4]。目前关于ART和ICP的研究甚少[5]，本研究以ART胎盘为切入点，探索ART助孕后ICP患者胎盘BSEP的表达，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月～2017年7月在本院分娩的自然单胎妊娠ICP患者15例（ICP组），年龄（29.12±3.13）岁，产次（1.82±0.71）次，孕周（37.77±5.13）周；同年温州医科大学附属第二医院分娩的IVF/ICSI助孕妊娠单胎ICP患者15例（ART组），年龄（30.52±2.91）岁，产次（1.78±0.32）次，孕周（37.13±6.39）周。另选正常单胎妊娠孕妇9例（对照组），年龄（30.77±4.35）岁，产次（1.90±0.22）次，孕周（37.19±7.95）周，ICP及ART组患者均无其他引起肝功能异常的疾病，无妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、心脏病等妊娠期并发症，对照组肝功能正常。ICP诊断依据2015年中华医学会妇产科学分会制定的ICP症诊疗指南[7]。各组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 胎盘收集

在胎儿娩出后5 min内留取新鲜母体面中央组织胎盘2 cm×2 cm×1 cm数块，取样避开脐带组织、胎膜蜕膜及坏死钙化区。组织获取后，立即并快速液氮冻存，-80℃冰箱中保存备用。

1.3 蛋白质印迹法（Western blot）

取100 mg标本，加入1000 μL RIPA裂解液，提取总蛋白后用碧云天的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，40 μg样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electropheresis，SDS-PAGE）分离，电转移至 PVDF膜（美国Abcam公司），转移膜室温封闭2 h，一抗4℃反应过夜，TBST 洗涤3次，加入二抗（按照抗体说明书进行稀释）中缓慢摇动120 min，TBST洗膜1次，ECL化学发光成像，实验重复3次，用Image J软件分析灰度值，待测蛋白的表达水平可用其条带的总灰度值与其内参蛋白GAPDH条带的总灰度值的相对值大小来表示。

1.4 实时荧光定量PCR

总RN A提取：从-80°冰箱中提取100 mg组织加入1 mL TRIzol（美国Thermo Fisher Scientific公司），静置10 min，按试剂盒步骤提取总RNA。RNA纯度及浓度的检测：在全波长酶标仪（Mini Trans-Blot Cell）上測定260 nm、280 nm处的吸光度值并得到比值，若其范围在1.8～2.0之间说明纯度尚可。RNA逆转录：按试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）步骤制备20 μL逆转录反应体系合成cDNA。实时荧光PCR反应：基因BSEP引物序列：上 游5CCTGGTCATCT-TGTGCTTCTTC3，下游5TCAATGAACCGCCTCTCCTT 3。β-actin为内参照，引物序列：上游5GCTATCCCTGTACGCCTCTG3，下游5TTAATGTCACGCACGATTTCCC3（上海碧云天生物技术有限公司）。PCR扩增体系50 μL；扩增条件为：94 ℃预变性2 min；94℃ 15 s PCR反应，62℃ 40 s，共40个循环。反应结束后利用系统自带的软件分析数据。

1.5 统计学方法

统计数据采用SPSS19.0软件处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料用率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR法检测BSEP mRNA在三组胎盘组织中的表达

BSEP在自然受孕ICP和ART胎盘中表达分别为（8.139±4.490）和（9.992±5.253），在正常妊娠胎盘组织中表达明显减少（1.038±0.271），ART组较ICP组表达量增加，但差异无统计学意义（P>0.05），而这两组与对照组差异均有统计学意义（P<0.001）。见封三图3。

2.2 Western blot检测BSEP蛋白在三组胎盘组织中的表达

BSEP在自然受孕ICP和ART胎盘中表达分别为（0.443±0.102）和（0.490±0.117），在正常妊娠胎盘组织中表达明显减少（0.161±0.013），ART组较ICP组表达量增加，但差异无统计学意义（P>0.05），而这两组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.001）。见封三图4。

3 讨论

随着国家二胎政策放开、生育大波的来临，带给产科医师和生殖医师巨大的挑战，产科面临疑难危急重症越来越多，生殖医学面临ART子代及妊娠风险的担忧。其中ICP是妊娠期危急重症里发生围产儿死胎、死产比例很高且病因不明的并发症，孕期的严密监护和个体化的治疗是ICP监管的有力措施。BSEP是胆汁酸的特异转运体，可调节胆汁酸的代谢，胎盘承载着大量妊娠相关讯息，是连接母儿的重要桥梁，ICP时母体胆汁酸升高经胎盘的胆酸转运体运送经过脐血，导致胎儿血清胆汁酸明显升高，其毒性对胎儿有致命的危害。因此，ICP胎盘胆汁酸转运功能的建立可能是造成ICP胎儿预后不良的环节之一。大量数据已表明BSEP可能参与ICP的发生发展[3-4]，本研究从与母儿均相关的胎盘出发，研究BSEP是否在ICP胎盘中表达，探索ICP可能的发病机制。我们应用Westren blot、RT-PCR等方法对正常妊娠、自然妊娠ICP胎盘及ART助孕ICP胎盘进行检测，评估ART子代胎盘是否存在发育机制异常。

结果显示，Westren blot和RT-PCR法均提示正常胎盘中BSEP mRNA和蛋白表达水平基因微量表达甚至不表达，而在ICP胎盘中高表达，其中ART来源胎盘较自然妊娠ICP胎盘表达量高，但差异无统计学意义（P>0.05）。Maeias等[6]研究发现母胎体内胆汁酸的合成、代谢及胆汁酸的胎盘运输是妊娠期胆汁酸循环的关键，Mazzella[7]研究报道ICP患者脐血中胆汁酸成分的变化与母血中变化一致，但浓度低于母血，提示胎儿体内这些升高的胆汁酸的母源性，更是在一系列研究中证实ICP存在经胎盘由母体向胎儿的胆汁酸转运。目前的研究提出哺乳动物肝脏胆汁分泌及运输主要由于BSEP介導的，考虑ICP胎盘中胆汁酸的转运过程可能有BSEP的参与，但我国学者刑爱耕等研究显示正常孕晚期胎盘中没有BSEP mRNA的表达，本研究结果显示正常胎盘中BSEP mRNA微量表达，而ICP胎盘中高表达，分析原因可能是由于BSEP基因突变或缺失所致BSEP mRNA上调，但国外学者[8-9]的研究认为BSEP基因突变对于ICP意义不大，故目前结论仍有争议。

ART的超生理剂量E2、黄体酮的使用，可能造成合体滋养层细胞血管重塑受限，胎盘缺血、缺氧，出现功能及结构异常，导致不良妊娠结局发生[11-15]。研究显示，ICP高发病率和ART妊娠有关，本研究通过三种不同的方法验证发现ART助孕ICP组的胎盘中BSEP蛋白表达较自然妊娠ICP组偏高，但差异无统计学意义，似乎提示我们ART助孕并不增加子代妊娠期ICP的发病风险，笔者分析ART的超促排卵、体外培养及胚胎移植等过程，阿司匹林、肝素的抗凝物的应用，改善了早期胎盘形成的需氧环境，并且ART中宫腔内操作和胚胎移植的准确定位可能对胎盘的发育和正常功能产生有利影响，然后从母源角度，在移植前治疗一切不利疾病背景，如：子宫内膜异位症患者GnRHa的应用或者腹腔镜下大量生理盐水的腹腔冲洗改善体内微环境，易栓症患者移植前进行免疫及抗凝治疗，高同型半胱氨酸之前的抗氧化治疗，宫腔镜处理宫腔内膜、息肉、粘连，输卵管积水的切除等均为胎盘的功能正常发挥提供了条件，两组结果虽有轻微差异，可能是本研究样本量少，而国内外鲜有相关报道，今后本课题组将会扩大样本量继续探索。

综上所述，BSEP蛋白在正常妊娠胎盘组织的低表达，而在ICP胎盘组织中高表达，可能是ICP发病原因之一，但自然受孕ICP胎盘和ART来源ICP胎盘中BSEP蛋白表达无差异，提示ART助孕并不增加子代ICP的发病风险。鉴于上述结论，笔者所在课题组下一步将探索三组胎儿脐血胆汁酸与母血胆汁酸之间的联系，观察ART子代胆汁酸代谢途径。

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（收稿日期：2017-10-28）