病死猪大肠埃希菌与变形杆菌的分离鉴定和药敏试验

路振香，孙 坤，夏礼贤，郭伟娜，刘 畅

(安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳 233100)

大肠埃希菌正常存在于人和恒温动物的肠道内，动物和人出生后，该菌经饮水、饮食等可由口腔进入肠道并在直肠内繁衍生存，终生存在于消化道内，且经粪便可不断向外排出[1]。少数血清型的大肠埃希菌为致病性大肠埃希菌，人和动物大肠杆菌病常见的2种原因，一是由于大肠埃希菌的寄生部位改变(如侵入尿道、生殖道、呼吸道等)；另一是由致病性大肠埃希菌引起的，如仔猪黄痢、仔猪白痢、猪水肿病的病原菌都是大肠埃希菌[2]。统计数据显示[3]，我国从2001年到2003年约104 511头仔猪感染仔猪黄痢，经济损失达5 000万元。我国华东区约30%的规模化养猪场其仔猪黄白痢的发病率在26%～32%之间，发病猪群中病死率通常在19.5%～22.3%之间。

变形杆菌为人畜共感染的机会致病菌[4]。据报道，1962年—2007年国内各个省份变形杆菌属导致重大食物中毒事件264起，中毒人数达1.7万人[5]。普通变形杆菌是多种细菌性感染与食物中毒的病原[6]。

本试验的病料采集自安徽省五河县某养猪场送检病猪。病猪主要表现为精神不振，食欲减少，体温升高，腹泻。主要病理变化为败血症，肠道广泛出血。采集病死猪的肝脏组织进行病原菌的分离培养、生化试验及药敏试验以及16 S rRNA序列PCR扩增和同源性分析，为该病的实验室诊断提供科学依据，为养殖户正确用药提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 安徽省五河县某猪场送检的病死猪3头。

1.1.2 试剂 2.5 μmol/μL dNTPs、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)，天根生化科技有限公司产品；生化试验试剂，上海国药集团化学试剂有限公司产品。

1.1.3 药敏纸片 妥布霉素、头孢他啶、头孢曲松、头孢呋辛、头孢噻吩、多黏菌素B、米诺环素、阿米卡星、庆大霉素、新生霉素、头孢唑肟、氧氟沙星、克林霉素、链霉素、克拉霉素、新霉素、左氟沙星、拉氧头孢、头孢吡肟等20种抗菌药物纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司，批号：20160415。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离培养、纯化、革兰染色及镜检 用接种环挑取肝脏组织然后划线在麦康凯琼脂平板上，37℃培养18 h～24 h，然后将长出的典型菌落划线接种于麦康凯琼脂平板上纯化，37℃培养18 h～24 h。将培养出的细菌抹片，革兰染色，油镜观察。

1.2.2 分离菌的生化试验 对分离菌进行糖发酵试验、吲哚(靛基质)形成试验、甲基红(MR)试验、VP试验、脲酶试验和产硫化氢试验。

1.2.3 分离菌的药敏试验 采用圆纸片法在营养琼脂平板上使用20种抗菌药物进行体外抑菌试验, 根据CLSI标准进行判定。

1.2.4 分离菌株DNA模板制备 取分离菌的纯培养物接种于LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取1 mL菌液，5 000 r/min离心10 min，去上清液，再加入50 μL超纯水重悬，煮沸10 min，冰浴5 min，12 000 r/min离心5 min，上清液即为细菌的DNA模板，置于-20℃备用。

1.2.5 分离菌16 S rRNA序列PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳 采用细菌通用引物[7]进行PCR扩增，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

反应体系： DNA模板5 μL、Taq聚合酶(5 U/μL)0.25 μL、10×Taqbuffer 5 μL、dNTPs(2.5 μmol/μL)4.0 μL，浓度为10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，用超纯水补充至50 μL。PCR反应条件： 95℃ 5 min； 60℃ 30 s，72℃ 2 min，共30个循环；72℃ 5 min 。将PCR产物使用10 g/L琼脂糖电泳，电压110 V，时间30 min，在凝胶成像系统观察、拍照。

1.2.6 分离菌16 S rRNA序列测定及同源性分析 测序由安徽通用生物系统有限公司完成,将测序结果进行同源性分析。

2 结果

2.1 病原菌分离培养、形态观察结果

从病死猪肝脏中分离到2株可疑细菌，分别标记为WHZ1和WHZ2，菌株WHZ1在麦康凯琼脂平板上为玫红色光滑、稍凸起、圆形、不透明中等大小菌落。菌株WHZ2在麦康凯琼脂平板上呈淡桔红色圆形、圆润、中等大小菌落。将菌株WHZ2接种在新鲜营养琼脂斜面的冷凝水中上有“迁徙生长”现象。

菌株WHZ1为革兰阴性、直杆状、两端比较钝圆杆菌；菌株WHZ2为革兰阴性，杆状或短棒状杆菌。

2.2 分离菌药敏试验

2株分离菌的药敏试验结果显示，菌株WHZ1对多粘菌素B和头孢他啶敏感，对米诺环素、阿米卡星中度敏感，对所选的其他药物(新生霉素、头孢唑肟、哌拉西林、妥布霉素、头孢呋辛、拉氧头孢、头孢曲松、头孢吡肟)都不敏感。菌株WHZ2对米诺环素、头孢噻吩中度敏感，对其他药物都不敏感。

2.3 分离菌生化试验

对分离菌进行生化试验，结果显示，菌株WHZ1能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖既产酸又产气，吲哚形成试验、MR试验均为阳性，VP试验、脲酶试验、产硫化氢试验均为阴性。菌株WHZ2仅能利用葡萄糖既产酸又产气，不能利用乳糖、蔗糖，吲哚形成试验、MR试验、脲酶试验和产硫化氢试验均为阳性，VP试验为阴性。

2.4 分离菌16 S rRNA序列PCR扩增结果

对2株分离菌的16 S rRNA序列进行PCR扩增，均扩增出了目的条带(图1)。

2.5 分离菌16 S rRNA序列测定结果和同源性分析

将菌株WHZ1与菌株WHZ2 16 S rRNA测序结果在GenBank中进行比对和同源性分析，结果显示，WHZ1菌株与大肠埃希菌属登录号为KY367384.1的大肠埃希菌同源性达到100%。WHZ2菌株与变形菌属登录号为EF426446.1的普通变形杆菌同源性达到99.9%。

M.DNA 标准DL 2 000;1.WHZ1； 2.WHZ2

M.DNA Marker DL 2 000;1.WHZ1； 2.WHZ2

图1 2种分离菌株16 S rRNA序列扩增结果

Fig.1 Amplification results of 16 S rRNA sequences of two isolates

3 讨论

使用麦康凯琼脂平板从安徽五河某猪场病死猪肝组织中分离到2株革兰阴性杆菌，即菌株WHZ1和菌株WHZ2；菌株WHZ1为红色光滑湿润稍凸起不透明中等大小菌落；菌株WHZ2为淡桔红色，完全透明光滑湿润中等大小菌落，且有“迁徙生长”现象。WHZ1菌株形态单一；WHZ2菌株为形态多样(杆状、短棒状等)。生化试验结果显示，WHZ1的结果与大肠埃希菌吻合，WHZ2的与变形杆菌吻合。对2株分离菌的16 S rRNA的序列测定，同源性分析结果显示，菌株WHZ1为大肠埃希菌，菌株WHZ2为普通变形杆菌。2株分离菌的耐药现象均十分严重，菌株WHZ1对多黏菌素B和头孢他啶敏感；对米诺环素、阿米卡星中度敏感；对所选的其他药(新生霉素、头孢唑肟、哌拉西林、妥布霉素、头孢呋辛、拉氧头孢、头孢曲松、头孢吡肟)都不敏感。菌株WHZ2对米诺环素、头孢噻吩中度敏感；对所选的其他药物均不敏感，这可能与该养殖场存在不合理使用抗菌药物有直接关系，该猪场有自家母猪生产刚断奶不久的仔猪的200多头，又从其他养猪公司购进了200多头刚断奶仔猪，没有经过隔离饲养就将新购进的仔猪放入上述猪相邻猪舍，结果新购进的猪到家3 d后，陆续出现精神不振，体温升高等现象，经当地兽医治疗，病情没有控制住，导致购进猪基本死亡，自家猪又陆续发病。由此可见，养殖场要有隔离舍，引进动物一定要放在隔离舍隔离饲养，观察一段时间，确定动物健康方可放入正常动物舍中，以免造成严重后果。同时，一旦发现动物发病，最好进行病原的分离培养、药敏试验，筛选出敏感的药物进行治疗。

[1] 陆承平.兽医微生物学[M].5版.北京:中国农业出版社,2012,94-97.

[2] 刘 峰,张 进,刘 毅.猪大肠杆菌病防治研究进展[J].湖南畜牧兽医,2010(6):1-3.

[3] 陈甜甜,杨忠福,刘建柱.猪大肠杆菌病研究进展[J].猪业科学,2008(8):20-25.

[4] 毕水莲,李 琳,唐书泽,等.变形杆菌属食物中毒的特点与防控措施[J].现代食品科技,2009(6):690-695.

[5] 李欣南,夏 欣,李永才,等.奇异变形杆菌耐药性研究进展[J].疾病监测,2016(5):427-432.

[6] Cohen-nahum K,Saidel-odes L,Riesenberg K,et al,Urinary tract infections caused by multi-duug resistantProteusmirabilis:Risk factors and clinical outcomes[J].Infection,2010,38(1):41-46.

[7] Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A,et al.16 S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol,1991,173:697-703.