南非蜱虫套式PCR鉴定方法的建立

王素华，闫宝龙，吴绍强，帅江冰，张晓峰，吕继洲

(1.温州出入境检验检疫局，浙江温州 325027；2.温州医科大学，浙江温州 325000；3.中国检验检疫科学研究院动物检疫所，北京 100029；4.浙江出入境检验检疫局，浙江杭州 310016)

蜱隶属节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲(Arachnida),蜱螨亚纲(Acari)，寄螨总目(Parasitiformes)，蜱目(Ixodida)。蜱目包括硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)和纳蜱科(Nuttalliellidae)，共计3科17属899种[1]。蜱是许多细菌、病毒、立克次体、螺旋体和原虫的传播媒介和贮存宿主，携带病原体的蜱叮咬人或动物后，可致使人或动物发病，所引起的疾病统称为蜱传疾病[2]。国内外相继发现了巴贝斯虫[3]、新布尼亚病毒[4]、塔拉萨维奇立克次体[5]、劳氏立克次体[6]等新发蜱传病原体及其所致疾病。当前，蜱和蜱传疾病的危害已经成为一个重大的社会公共卫生问题[7]。近年来，有关部门在进口南非生牛皮中截获了大量的媒介蜱，但对蜱的相关鉴定较少。为了弥补该项工作的不足，本文对截获到的南非蜱进行种类鉴定。蜱的鉴定一般借助于光学显微镜，以形态学特征为主，根据蜱分类检索表进行形态学分类鉴定[8]。但在光学显微镜下观察蜱的结构易受主观因素影响，且对于结构模糊、畸形、亲缘种的鉴别在形态上易混淆。随着分子生物学技术的不断发展，蜱的鉴定方法也随之发展[9]。DNA序列分析能够在基因水平上对比不同种的同源DNA序列，来分析样品的遗传变异情况；能准确获取基因组的特定序列片段的数据，对于鉴定蜱的种类，以及进行系统分类和发育研究有很大帮助[10]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器和试剂 琼脂糖、溴化乙锭，美国Sigma公司产品；树脂型基因组DNA提取试剂盒，北京赛百盛基因技术有限公司产品；胶回收试剂盒，美国OMEGA公司产品；DNA Marker DL 5 000、LATaq酶、10×PCR buffer、2 mmol/L dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司产品；M26型混合研磨仪，捷克RETECH公司产品；台式高速冷冻离心机、DK-600A型电热恒温水浴锅，美国Thermo Scientific公司产品；Bio-Rad电泳仪、PCR仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.1.2 蜱虫来源 2016年4月—2016年11月在进口的南非生牛皮上截获到数千只蜱虫，将蜱虫装入洁净的采集瓶中，带回实验室待检。

1.2 方法

1.2.1 蜱虫的形态学鉴定 将蜱虫进行清洗处理后，在光学显微镜下观察蜱虫的假头基、基突、盾板、侧沟、须肢、生殖孔、足基节、肛沟和气门板等形态学特征，根据蜱虫分类检索表进行形态学分类鉴定(图1)。

1.2.2 引物的设计与合成 根据GenBank中蜱虫18 S rRNA序列保守区设计两对特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物核酸序列见表1。

图1 蜱类分属简要检索表

表1 18 S rRNA引物的核苷酸序列

1.2.3 蜱虫基因组DNA提取 先将形态学鉴定为不同种的蜱虫各1只清洗处理后分别在混合研磨仪中研磨，按照基因组提取试剂盒说明进行基因组DNA提取，样品无需RNA酶处理，置-20℃保存备用。

1.2.4 套式PCR克隆策略 克隆分两步，按照图2所示进行。

以蜱虫基因组DNA为模板，以T18sF1+T18sR1为第1套引物扩增18 S rRNA基因片段。25 μL PCR扩增体系：10×PCR buffer 2.5 μL，T18sF1、T18sR1引物(10 mmol/L)各1 μL，LATaq酶(5 U/μL)0.25 μL，dNTPs(2 mmol/L)2 μL，基因组DNA 2 μL，ddH2O 16.25 μL。进行第1轮PCR，扩增条件为：95℃ 5 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 2 min，10个循环；72℃ 10 min。15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

以第1轮PCR产物DNA为模板，分别以T18sF1+ T18sR2、T18sF2+T18sR1为第2套引物，扩增18 S rRNA基因片段。25 μL PCR扩增体系：10×PCR buffer 2.5 μL，T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1引物(10 mmol/L)各1 μL，LATaq酶(5 U/μL)0.25 μL，dNTPs(2 mmol/L)2 μL，第1轮PCR产物DNA 1 μL，ddH2O 17.25 μL。进行第2轮PCR，扩增条件为：95℃ 5 min；94℃ 1 min；60℃ 1 min，72℃ 2 min，25个循环；72℃ 10 min。15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

图2 18 S rRNA套式PCR克隆示意图

1.2.5 DNA序列测定及系统进化分析 PCR阳性产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。利用Seq Man软件拼接序列后，通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)，利用“BLAST”工具和采用DNA Star中的Meg Align软件对序列进行同源性比较，并运用MEGA5.0软件，进行系统进化分析。

2 结果

2.1 南非截获蜱形态学鉴定

光学显微镜下观察蜱，根据外观和形态不同，将截获的蜱虫分成10种，命名为T1～T10。根据盾板、假头基、气门板、肛板、肛沟和足基节等形态特征，参考蜱类分属检索表，进一步进行形态学分类鉴定(图3)。

图3 进口南非生牛皮中截获蜱形态学观察

对照蜱类分属简要检索表，发现T1、T2、T3、T4、T7和T8分别属于花蜱属(Amblyomma)的不同种或亚种；T5和T6分别是牛蜱属(Boophilus)的不同种或亚种；T9和T10分别是扇头蜱属(Rhipicephalus)的不同种或亚种。

2.2 蜱虫基因组DNA

对经过形态学初步鉴定的10种蜱，每种蜱虫取1只，按照基因组DNA提取试剂盒说明提取蜱虫基因组DNA，提取的基因组DNA浓度为50 ng/μL～100 ng/μL。

2.3 套式PCR扩增蜱基因及序列分析

以所获得的蜱虫基因组DNA为模板，经两轮PCR扩增18 S rRNA基因，通过15 g/L琼脂糖凝胶电泳初步鉴定产物，10种测试样品均出现目的条带(图4)。

应用Meg Align软件将所获得的样本序列与GenBank中已知参考序列进行核苷酸相似性比较分析。基因序列分析显示，样本T1、T2、T3和T4的18 S rRNA与Amblyommarotundatum(KJ584369.1)的同源性为100%；样本T7和T8的18 S rRNA与Amblyommamaculatum(L76344.1)的同源性为99%；样本T5和T6的18 S rRNA与BoophilusmicroplusBiarra(Z74481.1)的同源性为100%；样本T9和T10的18 S rRNA与Rhipicephaluszambesiensis(KC769615.1)的同源性为99%。

2.4 系统进化分析

将T18sF1+ T18sR2和T18sF2+T18sR1引物分别扩增到的PCR产物测序后拼接，得到18 S rRNA基因序列，与NCBI中已公布的蜱虫18 S rRNA基因序列进行比对，应用MEGA5.0软件进行系统进化分析。结果显示，T1、T2、T3和T4与Amblyommarotundatum在同一分支上，是花蜱属的亚种；T7和T8与Amblyommamaculatum在同一分支上，也是花蜱属的亚种；T5、T6、T9和T10分别与BoophilusmicroplusBiarra和Rhipicephaluszambesiensis在同一分支上，是牛蜱属和扇头蜱属的不同种或亚种；与光学显微镜下的形态学鉴定结果基本吻合(图5)。

图4 套式PCR扩增18 S rRNA基因片段电泳结果

图5 10种蜱虫基于18 S rRNA序列的系统进化分析

3 讨论

蜱的种类鉴定需要具有鉴定经验的专业技术人员，一般人掌握起来比较困难。随着科技的发展，分子生物学方法在物种鉴定和病原检测中得到广泛应用。18 S rRNA基因是常用于分子生物学鉴定的候选基因[11]，该序列高度保守，PCR容易扩增，GenBank数据库中相关序列信息丰富，方便做比对分析，但国内目前几乎没有对国外传入蜱种进行鉴定的报道。因此，本研究对经形态学初步鉴定的10种蜱的18 S rRNA基因序列进行了测定和分析，并将其与GenBank中已经公布的3个种属蜱的序列进行对比。序列分析和系统进化分析显示，从进口的南非生牛皮上截获的蜱分别是花蜱属、牛蜱属和扇头蜱属的不同种或亚种，T1、T2、T3、T4与T7和T8之间的亲缘关系较近，但它们之间也存在一定的差异，属于花蜱属的不同种或亚种；T5、T6、T9和T10之间的亲缘关系较近，是牛蜱属和扇头蜱属的不同种或亚种，而近年来的蜱种分类学也已经将牛蜱属合并到扇头蜱属[12]。本次经形态学和分子生物学综合鉴定得出的花蜱属、牛蜱属和扇头蜱属可作为媒介传播巴贝斯虫、环形泰勒虫、布鲁菌、立克次体和牛结节性皮肤病病毒等病原微生物，不同蜱种在蜱传疾病的发生和传播中所起作用值得进一步研究[13]。

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