西藏林芝地区藏猪肺炎支原体感染情况的调查

邱 刚，芮亚培，刘锁珠，李 坤，韩照清，黄淑成，罗厚强，兰彦芳，李家奎*

(1.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000；2.华中农业大学动物科技学院动物医学院，湖北武汉 430070)

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)引起的一种慢性消耗性传染病，又称猪地方流行性肺炎[1]。该病在我国养猪业中常见多发，给藏猪养殖带来较大经济损失。环境变化和猪肺炎支原体侵袭是导致该病的主要原因[2]。虽然猪肺炎支原体单纯感染时往往表现出感染率高而病死率低，但猪肺炎支原体作为其他感染性疾病的先导，通过侵袭呼吸道导致呼吸道纤毛黏结、折断、脱落，为其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型、巴氏杆菌、链球菌等的感染提供重要的条件，引起病死率上升。

藏猪主要分布于海拔2 900 m～4 100 m的高原地带，在藏猪的栖息地昼夜温差可达20℃以上，藏猪生长于野外并没有圈舍用来抵御严寒，在较为极端的环境下，呼吸道疾病在藏猪群中较为常见。据调查，散养藏猪均未经猪肺炎支原体疫苗免疫接种，因此猪肺炎支原体易于通过带菌猪向猪群传播[3-5]。藏猪地方性肺炎临床症状多表现为咳嗽、哮喘、生产性能下降，主要病理变化是肺部实变，血管周围和细支气管周围淋巴细胞浸润，出现Ⅱ型肺泡细胞增生和肺泡炎症。

迄今为止，关于藏猪地方性肺炎的研究报道极少，事实上在藏猪养殖中该病危害很大，常给当地养猪业带来重大经济损失。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种准确、高效、经济的检测方法[6-7]，因此，本试验采用ELISA对随机采样的藏猪群进行猪肺炎支原体流行病学调查，以了解该病在藏猪群中的流行情况，为藏猪支原体肺炎防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 各生长阶段藏猪454头，分布于藏猪原产地西藏林芝地区米林县、林芝县和工布江达县。

1.1.2 主要试剂 猪肺炎支原体抗体检测试剂盒(IDEXX，M.hyo. Ab Test kit)，北京爱德士元亨生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器和耗材 酶标仪(Thermo Scientific Multiskan MK3型)，Thermo fisher公司产品；离心机(Sigma 3K15)，Sigma公司产品；微量移液器， Eppendorf公司产品；超净工作台(SW-CJ-2F)，成都一恒科技有限公司产品；未添加抗凝剂一次性负压真空采血管(5 mL)，江苏美康医疗检验用品公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 在林芝地区林芝县、米林县和工布江达县的牧区，随机对牧民散养的成年藏猪颈静脉采血，藏仔猪采用前腔静脉采血，记录采样地点，性别，生长阶段，共收集454份藏猪血液样品，及时送往西藏农牧学院兽医药理学实验室以3 000 r/min离心，分离血清，置-20℃储存，备用。

1.2.2 猪肺炎支原体抗体阳性率测定 藏猪血清样品室温(15℃～25℃)解冻，在使用前用样品稀释液将被检样品进行40倍稀释(将10 μL样品加入390 μL稀释液中)。10倍浓缩洗液恢复到18℃～26℃，摇动混合，使析出的盐类完全溶解。在使用前用蒸馏水或去离子水将浓缩的洗液(10×)进行10倍稀释。所有试剂在使用前恢复至18℃～26℃，旋转或颠倒混匀。ELISA具体操作按说明书进行。

1.2.3 判定标准 当阳性对照平均值减去阴性对照平均值的差值大于或等于0.150；阴性对照平均值小于或等于0.150 的时候，检测结果有效。M.hyo抗体是否存在是由样品OD 650 nm与阳性对照平均值的比值(S/P)决定。阳性对照是标准化的，它代表猪血清或血浆中的有效抗体水平。样品的相对抗体水平按照说明书计数。

1.2.4 统计分析 不同性别、地域和生长阶段的藏猪支原体肺炎血清阳性率数据通过Spss19.0软件进行卡方检验，检验双向进行，当P<0.05时表明差异显著。

2 结果

由表1可知，454份血清样品中共计330份经猪肺炎支原体抗体ELISA试剂盒检测为阳性，血清阳性率为72.69%。在454份血清样品中，290份采自林芝县，血清阳性率75.17%，148份采自米林县，血清阳性率68.24%，16份采自工布江达县，血清阳性率为68.75%。以上3个县的血清阳性率经卡方检验差异不显著(P>0.05)，林芝县散养藏猪肺炎支原体血清阳性率高于米林县和工布江达县。

由表2可知，根据性别统计，雄性藏猪血清阳性率为70.92%，而雌性藏猪为75.40%，经统计分析二者差异不显著(P>0.05)，但雌性藏猪肺炎支原体血清阳性率更高。

表1 不同地域藏猪肺炎支原体血清阳性率

由表3可知，根据生长阶段统计，种公猪、繁殖母猪、屠宰猪、肥育猪、育成猪、仔猪的血清阳性率分别为33.33%、50.00%、67.74%、76.38%、74.78%和79.17%，差异显著(P<0.05)。其中藏仔猪肺炎支原体阳性率最高，在150日龄以内藏仔猪M.hyo抗体阳性率为79.17%，然后随着年龄增长呈现出下降的趋势，至育成阶段(150日龄～360日龄,16 kg～24 kg) 下降为74.78% ；到育肥阶段的(361日龄～460日龄,25 kg～40 kg)又有所上升达到76.38%，到屠宰阶段(>460日龄,>40 kg)下降为67.74%。

结果证实，在西藏林芝各地，无论性别，在藏猪生长发育的各个阶段，猪支原体肺炎已经在藏猪群中广泛传播，严重影响藏猪的生长发育，危害巨大，已经成为需要加以关注的藏猪主要疫病，必须采取适当措施对该病加以防控。

表2 不同性别藏猪肺炎支原体血清阳性率

表3 不同生长阶段藏猪肺炎支原体血清阳性率

注：成年雄性藏猪(>460日龄,>40 kg)，藏母猪(>460日龄,>40 kg)，屠宰藏猪(>460日龄,>40 kg)，育肥藏猪(361日龄～460日龄,25 kg～40 kg)，育成藏猪 (150日龄～360日龄,16 kg～24 kg)，藏仔猪(<150日龄，<16 kg);角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Adult male Tibetan pigs(>460 days,>40 kg)，adult female Tibetan pigs(>460 days, >40 kg)，slaughter Tibetan pigs(>460 days,>40 kg)，fattening Tibetan pigs(361 days-460 days, 25 kg-40 kg),growing Tibetan pigs(150 days-360 days,16 kg-24 kg)，Piglets of Tibetan pigs (<150 days, <16 kg);The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

3 讨论

藏猪为高原小型猪种，生长缓慢，与规模化养殖生长速度较快的其他品种猪不同，在仔猪阶段所检测的血清大部分采自60日龄以上的群体，因此母源抗体对最终结果的干扰比较有限，检测结果基本反映的是M.hyo的感染情况。试验结果表明，藏猪肺炎支原体感染相对严重，尤其是肥育猪、育成猪和仔猪，三者猪肺炎支原体血清阳性率高达76.38%、74.78%和79.17%。M.hyo由母猪向仔猪传播很可能是导致藏猪生长早期阶段血清阳性率居高不下的主要原因。寒冷的自然环境，粗放的管理方式和病原体的感染可能是导致藏猪肺炎支原体感染率较高的原因。大多数有呼吸道症状的藏猪其血清为猪肺炎支原体阳性。细菌的分离和培养仍然是确诊该病的“金标准”，但猪肺炎支原体是公认难于培养和非常费时的病原微生物之一。尽管PCR具有稍高的灵敏度和特异性，ELISA试剂盒与之相比具有在基本保证准确性的前提下缩短检测时间和降低成本的优势，尤其对于藏猪群体水平的检测。Peter报道称带菌野猪并不表现出明显的肺部病变而假定野猪仅仅是亚临床感染[9]，本次检测结果与此一致。藏猪的猪肺炎支原体感染率显然高于时新春等[10]对于藏猪支原体肺炎流行病学调查的报道(阳性率为58.86%)，可能原因是藏猪支原体肺炎的感染是一个动态过程，不同的时期、不同的采样地点、不同猪群对检测结果具有一定的影响。并且，显然以前的报道中并未发现屠宰藏猪的肺部眼观病变比例较高。

与其他传染病一样，预防接种是一个行之有效的预防藏猪地方流行性肺炎的方法，但是据调查，由于当地传统而粗放的管理方式，对该病的危害认识不足，以及政府并未将该病列入重大动物疫病防疫范围，多种客观条件制约之下，大多数藏猪并未接种猪肺炎支原体疫苗。藏猪地方流行性肺炎的防控措施包括参考集约化猪场净化猪支原体肺炎的瑞士减群法或其改良方法,加强饲养管理早期隔离断奶(SEW)和“三点式”分区管理生产方式(将哺乳仔猪、保育仔猪及育肥猪分开饲养以达到减少或切断病原从母猪传播给仔猪的目的)、适当使用药物和疫苗[8]。基于藏猪放牧和社会性动物的特点，藏猪地方流行性肺炎易于在猪群内和猪群间传播，并且最常表现在母猪与仔猪中传播[11]。猪肺炎支原体灭活苗与弱毒苗已经广泛使用，但据报道并不能达到100%防治该病的目的，可能是因为哺乳仔猪疫苗接种过早，受母源抗体影响，产生抗体滴度不足，特定疫苗对藏猪保护力不佳等所致。早期疫苗注射需要配合其他综合措施及药物治疗才能有效遏制该病发生与传播。对于猪群净化猪肺炎支原体的措施，可以对瑞士减群法或其改良方法再次加以合理改进[12]，充分结合西藏本地实际，增设仔猪保育圈舍及设施，将母猪和仔猪适当隔离，再配合药物治疗发病猪，对未发病猪群进行合理的预防接种，通过一定时期多种措施的应用，应当可以有效的降低M.hyo的感染率和发病率，从而逐渐净化猪群。在药物的使用上四环素类的多西环素，大环内酯类的泰乐菌素，替米考星与泰万菌素，氟喹诺酮类的甲磺酸达氟沙星与恩诺沙星，截短侧耳素类的沃尼妙林等仍然是防控猪支原体肺炎的主要药物。据报道，欧洲各国已经使用泰拉霉素结合瑞士减群法成功净化多个规模化猪场，此法可以在感染严重的藏猪群中加以合理使用。

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