动物细胞规模化培养技术现状

楚品品，蒋智勇，勾红潮，宋 帅，李 淼，李 艳，李春玲，蔡汝健

(广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640)

随着重组DNA技术在20世纪70年代的出现，使得生产特定基因编码的蛋白质成为可能。细菌和酵母细胞的相关技术较成熟，并且生长容易，成为了早期生产重组蛋白的主要载体。但是对于生产复杂的蛋白及需要翻译后再修饰的蛋白而言，这些生产系统便显示出了其固有的局限性，而动物细胞培养技术的应用及规模化培养的出现很好地弥补了这一缺陷。

动物细胞培养最早可追溯到1885年，离体的鸡胚组织于温生理盐水中可存活数天。真正成为一项技术被广泛应用始于1907年，美国生物学家Harrison R G[1]成功在试管中培养蛙胚神经组织数周并观察到细胞突起的生长过程[2]。最初对于动物细胞的培养是为了研究细胞的代谢和生长，随后发现其有更广泛的应用，之后细胞培养技术不断成熟，被用于生物学和医学等各个领域。经过一个多世纪的探索与发展，细胞培养技术从实验室走向工业化生产。随着基于细胞培养技术的蛋白质医药和疫苗等生物制品成为生物医药的主导以及需求量和质量的不断提高[3-4]，多种动物细胞规模化培养技术应运而生并不断发展，倍受科研机构和高新技术企业的关注，显示出了极好的工业发展前景[5]。

1 哺乳动物细胞规模化培养方式

按细胞在体外培养时的生长特性将哺乳动物细胞分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞，前者体外培养时只有附着于特定的物质表面才得以生长繁殖，而后者在体外培养时不需要任何附着物，悬浮状态下即可完成整个生长繁殖过程。为了达到生产要求，需要扩大细胞培养的体积及提高细胞培养密度，规模化细胞培养技术主要是在pH、温度、培养基成分等条件可控下，运用生产设备培养细胞使之达到较高密度用于生产相应生物制品的技术，主要培养方式有贴壁培养、悬浮培养和固定化培养。

1.1 贴壁培养

规模化贴壁培养的经典方法是转瓶培养。转瓶培养是将贴壁细胞置于经过表面处理的转瓶内，同时注入一定量培养液，转瓶以一定转速旋转，细胞交替接触空气和培养液，以维持细胞的生长繁殖。最早由Wells R P[6]于1870年申请了转瓶的相关专利，以圆形培养瓶置于转轴上旋转，从而加大细胞的贴壁面积，对细胞进行规模化培养。此后，研究者们以最大限度的增大转瓶的内表面积为目的设计了多种内部结构，以进一步提高细胞量。如1976年到1991年间，分别提出了在转瓶中加入塑料卷轴、中空环形小室、泡沫型多孔填充物及波浪形内壁等设计，此外于1999年和2004年打破以往的圆形转瓶的设计，出现了多角形转瓶和螺旋形转瓶，这些设计都在一定程度上增大了细胞密度，提高了产量。

转瓶培养作为传统的规模化贴壁培养方式，结构及操作相对简单，耗资少，只需简单增加转瓶数目即可实现扩大培养，产品收获方便。早期应用广泛，为基于细胞培养生产的药物及疫苗做出了贡献。但由于其所需劳动强度较大，培养参数无法检控，难以实现均一化，使得批间差异较大，有限的贴附面积限制了产量的进一步提高等原因，以及悬浮培养及固定化技术的出现和不断成熟，使得转瓶培养技术逐渐被淘汰。《中华人民共和国农业部公告》第1708号中明确规定，自2012年2月1日起，各省级兽医行政管理部门停止对转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目的兽药GMP验收申请[7]。

1.2 悬浮培养

规模化悬浮培养方式类似于微生物发酵，即细胞在生物反应器中随着培养液的运动而处于分散悬浮的状态进行生长繁殖，达到较高的密度，进而用于生产各种产品。悬浮培养可分为全悬浮培养和贴壁微载体悬浮培养，微载体悬浮培养也属于固定化培养方式，通常所说的悬浮培养是指全悬浮培养。以悬浮培养方式进行规模化细胞培养始于1965年。Capstick P B等[8]于1962年驯化贴壁生长型细胞乳仓鼠肾细胞(baby hamster kidney 21，BHK-21)进行悬浮生长，并于1965年借鉴微生物发酵原理在不锈钢发酵罐中悬浮培养BHK-21细胞用于兽用疫苗生产，获得成功[9]。规模化悬浮培养因其诸多优点，自出现便备受关注，成为研究热点[10]。

规模化悬浮培养最大的优势在于通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。进行悬浮培养的细胞属于非贴壁依赖性细胞，具有传代方便(不需消化处理)，易于收获细胞等特点，除此以外，规模化悬浮培养借鉴于微生物发酵。基于微生物发酵拥有较成熟的理论和经验，以生物反应器为生产设备的悬浮培养技术迅速发展起来，其自动化程度高，节省了人力的同时也降低了因人为操作而造成的污染，对细胞生长环境进行实时监控，随时掌握细胞用于生产的最佳状态，进而提高了产品的产量和质量，放大效应小，大大提高了细胞密度等。此外，由于血清的使用造成的成本高，批间差异大，生产工艺及产品质量不稳定，以及后续纯化过程复杂等原因[11]，使得无血清培养液的研发及使用越来越受到关注，而悬浮培养过程恰可以实现细胞的无血清生长过程。众多优势之处使得规模化悬浮培养成为了动物细胞规模化培养的理想模式。

实现规模化悬浮培养的关键技术主要有4个，即贴壁细胞的驯化改造，个性化培养基的研制，生物反应器的选择及培养工艺的选择及优化。生产用大多数细胞为贴壁生长型细胞，要实现规模化悬浮培养，第一步就是对贴壁细胞进行驯化或者改造以适应悬浮生长状态。如1997年，一株马-达二氏犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)通过连续传代的方式被驯化为悬浮细胞；2009年，另一株MDCK细胞通过转染入siat7e基因被成功改造[12]。此外还有小鼠骨髓瘤NS0细胞(mouse myeloma line NS0)、人胚肾细胞(human embryo kidney-293，HEK293)、 BHK21细胞、非洲绿猴肾细胞(African green monkey kidney，Vero)、中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)和人类视网膜细胞永生化和细胞系细胞(cell line derived from primary human retina cells that were immortalized upon transfection with the E1 region of adenovirus type 5，PER-C6)等实现了悬浮生长，并用于生产。其中CHO细胞因其诸多优点，成为工业化生产重组蛋白应用最广泛的细胞系[13-14]。随着多种可用商业化培养基的开发和优化使得驯化过程变得相对容易[15]。同时对于不含血清培养基的开发很好的规避了血清带来的弊端，经过无血清培养基、无动物源培养基，到无蛋白源培养基和化学成分限定培养基，培养基的开发已经实现质的飞跃[16]。但是对于驯化的悬浮细胞而言，由于不同细胞营养需求不同，对悬浮状态的适应性不同，用于生产的目的也不同，所以需要个性化的无血清培养基来支持。研究表明，个性化培养基的使用能够明显提高产品的产量和质量[17]。

生物反应器作为悬浮培养的关键设备，必须能够为细胞生长、繁殖及代谢提供稳定无菌的环境，具备良好的混合功能和低剪切力，此外还要具有规模的可放大性以满足生产的需要。搅拌式生物反应器的建立，成功的解决了悬浮培养过程中细胞剪切敏感性以及传氧问题等，成为悬浮细胞规模化培养的首选，迄今为止应用最为广泛[18]，最大体积已达20 000 m3。与搅拌式生物反应器相比，气升式生物反应器因其耗电量低、剪切力低、内部无结构，灭菌更彻底等优点，得到一定程度的应用，最大体积达17 000 m3。除此之外，一次性生物反应器开发，因其具有反应器预先灭菌，即开即用，省去在线清洗、灭菌，以及验证，一次性投入低，避免交叉污染等优点，很大程度的促进细胞培养的发展，成为生物制药领域发展的一个重要方向[19-20]。不同反应器还要选择合适的培养工艺，流加培养和灌注培养相比分批培养更有优势，流加培养在分批培养的基础上补充新的培养液[21]，灌注培养是增加了截留装置，保留细胞始终在反应器中而只有培养液的不断流动。灌注培养较好的实现了营养物质的补给及代谢废物的排出，成为将来的发展趋势，但是培养基的利用率较低而且操作及装置过于复杂，有待进一步的突破和优化[22-24]。

悬浮培养技术尽管有诸多优点并且是动物细胞规模化培养的理想模式，但仍然存在诸多问题有待解决，如生产用大多数细胞为贴壁生长型细胞，难以实现悬浮培养，虽然已有细胞株能够满足蛋白质类药物的生产，但对于多种病毒疫苗的生产却难以实现。此外，反应器的剪切力，混合效果及扩大培养等问题，虽然得到一定程度的解决，但仍期待更好的解决方案。

1.3 固定化培养

细胞固定化规模培养方式来源于固定化酶技术，即将细胞以物理或化学手段限定于一定空间区域内进行生长繁殖，达到较大的细胞密度，进而用于生产。由于生产过程需要细胞保持较高的活性，因此需要采取相对温和的方法对细胞进行固定，通常采用吸附法或者包埋法[25]，由此衍生出的固定化规模培养技术有微载体培养，中空纤维系统培养，微囊化培养等，其中微载体技术最为成熟并且应用最广。

1.3.1 微载体培养 微载体细胞培养技术由荷兰学者van Wezel A L[26]于1967年提出并创立，微载体的出现和不断成熟弥补了转瓶培养等传统贴壁细胞培养工艺的缺陷，成为贴壁细胞规模化培养的重要方法，也使得细胞培养的工业化更上一个台阶。

微载体是指一类直径在60 μm～250 μm的无毒、非刚性、密度均一的微球型颗粒，允许贴壁依赖性细胞贴附在其表面进而以悬浮状态生长[27-28]。微载体培养技术综合了贴壁培养和悬浮培养的优点，提高了贴壁细胞的培养规模，在有限的空间里提供更大的贴附面积；贴壁细胞在微载体上生长失去接触抑制，可形成多层，获得更高的细胞密度；实现了贴壁细胞培养的自动化可控化管理，减少了人力，降低了污染几率，提高了产品产量的同时还保证了质量。虽然微载体培养很好的解决了传统转瓶培养贴壁细胞存在的问题，但也出现了新的问题，微载体培养继承了悬浮培养的缺陷，剪切力对细胞的损害，凋亡细胞不及时的清除等可引起细胞的大面积死亡；随着细胞数量的增加要及时补充微载体，但是微载体的补给增加了操作难度和污染几率；微载体对细胞的生物学作用还不清楚；不能实现培养的阶段性控制；对反应器的要求更高；此外微载体的价格普遍昂贵；没有一种微载体适合所有细胞；部分微载体难以降解和回收等[29-31]。

1.3.2 中空纤维系统培养 中空纤维细胞培养系统由Knazek P A等[32]于1972年提出。一般的细胞体外培养是在二维平面上生长，失去了体内的立体空间性，而中空纤维系统很好的模拟了细胞在体内的三维生存状态。中空纤维类似于毛细血管，管壁为半透膜，允许一些小分子物质及规定的物质通过。多数纤维集中于圆筒中构成中空纤维培养系统的培养室，纤维内外形成两个腔室，培养液流动于纤维内，细胞生长在纤维外腔室。该培养系统的优点在于很好的模拟了细胞在体内的三维生长状态；体积小，却能够在很小的体积里提供相当大的表面积，供细胞高密度生长；不存在剪切力对细胞的破坏；细胞生长周期长；通过选择半透膜孔径就可以控制某些代谢物质的流动，从而控制对细胞的影响或者浓缩产物；获得高浓度和高纯度的产物。缺点在于对于细胞的观察比较困难；物质的流动造成纤维膜的堵塞；过量气体的产生或者细胞的生长破坏纤维。

1.3.3 微囊化培养 微囊培养起源于20世纪70年代，属于包埋法，却又区别于传统的包埋法(仅将细胞包埋入生化材料内)，它是以选择性半透膜同时包裹拟培养细胞、培养介质及营养物质形成的微囊体，微囊内形成了允许细胞生长的微环境，而微囊处于培养系统大环境之中，通过半透膜与囊内进行一定的物质交换。该系统的优点在于半透膜的存在保护了细胞免受剪切力等物理损伤；获得高的细胞密度；产物浓度高，方便纯化处理等。缺点在于微囊的制作过程复杂，成功率不高，质量标准难以控制[33]，微囊内死亡细胞极易影响活细胞以及产物的形成，另外产物的收集必须破壁，无法实现连续化生产等[34]。微囊化培养更多的趋向于临床应用[35]。

2 问题及展望

自实行动物细胞规模化培养以来，以细胞培养为基础的各种产品在产量和质量上都有了飞跃性的发展。但是各种培养技术和方法都存在着阻碍其广泛应用的不足之处，诸如生产用细胞多数为贴壁细胞，难以实现悬浮培养；微载体的关键技术为少数大公司所有，使得微载体使用的成本高；中空纤维培养技术纤维材料还有待开发；各种反应器还不能够更好的符合各种培养方法的要求；一次性反应器的体积还有待增大；无血清培养基开发成本高，使用范围窄等。在科技不断发展的今天，这些不足有待更新和改善，以更好地实现细胞规模化培养。而作为动物细胞培养的理想方式，无血清全悬浮培养体系的建立，将可以从根本上解决动物细胞规模放大问题，以更好的符合生物医药行业的发展和需求。

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